تعزيز محتوى الورم من خلال التشريح الكلي للورم

غالبا ما تكون الأنسجة المدمجة في البارافين الثابتة بالفورمالين أو FFPE عبارة عن خليط من المواد السرطانية وغير السرطانية ، حيث يكون وجود مواد غير ورمية في كثير من الأحيان غير مرغوب فيه ويمكن ، إذا كان موجودا بنسبة عالية ، أن يؤثر بشكل كبير على نتائج التحليل الجينومي ، وبالتالي فإن الميزة الرئيسية للتشريح الكلي مقارنة بالعمل مع الأنسجة غير المقطوعة هي أنه يمكن جمع أقسام الأنسجة المستقطعة المنزوعة البارافين الناتجة عن ذلك لاستخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك بثقة في التحليل الجينومي النهائي. مع العلم أن المواد المستخرجة مشتقة من الأنسجة ذات المحتوى المعزز للورم مع الحد الأدنى من المساهمات من تلوث الأنسجة غير الورمية. سيتم عرض سير العمل متعدد الخطوات لهذه العملية من قبل السيد لي ويسنر والدكتور براندون لارسن وأنا استعدادا لتقسيم الأنسجة ، قم بنقع كتل البارافين على الماء المثلج لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

تقشعر لها الأبدان الكتل تصلب الشمع في حين أن الماء يرطب الأنسجة ، مما يجعل قطع الأنسجة أسهل. أثناء وجود الكتل على الجليد ، قم بتسمية شرائح المجهر بشكل مناسب. املأ الحمام المائي وسخنه إلى 39 درجة مئوية واضبط الميكروتوم على سمك القطع المطلوب.

قم بتحميل الشفرة بعناية على الميكروتوم. قم بقفل الشفرة في مكانها ووضع واقي الأمان حتى تصبح مستعدا لبدء تقسيم الكتل. أثناء وجود واقي الأمان في مكانه ، أدخل كتلة FFPE في ظرف microtome.

للبدء ، قسم الكتلة ببطء حتى يتم الحصول على قسم الوجه الكامل. يعرف هذا باسم مواجهة الكتلة. بمجرد تحقيق ذلك ، يمكن أن تكون الكتلة في القسم بشكل أسرع للحصول على شريط من الأقسام.

بمجرد القطع ، انقل شريط أقسام الأنسجة إلى حمام الماء الدافئ. استخدم الملقط لفصل مقطع واحد من الأنسجة بعيدا عن الشريط. للقيام بذلك ، ضع الجزء الخلفي من الملقط المنحني المغلق في المفصل بين القسمين واسمح للملقط بالفتح بلطف لفصل الأقسام.

اجمع قسم الأنسجة المعزولة على شريحة المجهر. لتجنب محاصرة الفقاعات، أدخل شريحة المجهر في الماء بزاوية. رج الشريحة بلطف لإزالة الماء الزائد قبل وضعها على الرف لتجف في الهواء.

بمجرد أن تجف ، حدد واحدا على الأقل من أقسام الأنسجة المقطوعة حديثا لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين ، المعروف أيضا باسم H و E.بمجرد تلطيخ شريحة H و E لمراجعة علم الأمراض. أثناء مراجعة علم الأمراض ، يقوم أخصائي علم الأمراض الخبير بمراجعة شرائح بقع H و E لتحديد مكان الأنسجة ذات الأهمية في كل نسيج. يقوم أخصائي علم الأمراض أولا بمراجعة الأنسجة بأكملها لتحديد مكان وجود الأنسجة ذات الأهمية داخل الأنسجة.

بمجرد اكتمال المراجعة الأولية للأنسجة والمورفولوجية ، يستخدم أخصائي علم الأمراض قلم تمييز الشريحة للتعليق على كل شريحة ملطخة H و E. باستخدام العلامة ، يرسم أخصائي علم الأمراض دائرة حول الأنسجة ذات الأهمية ، باستثناء الأنسجة غير المثيرة للاهتمام. ثم تتكرر عملية المراجعة هذه لجميع الشرائح الملطخة H و E في المشروع.

قم بإعداد مساحة عمل طاولة التشريح الكلي التي تسمح بمعالجة كل عينة بالتتابع والكفاءة. لكل عينة ، يجب أن تكون H و E التي تمت مراجعتها بشكل مرضي ، وأقسام الأنسجة المثبتة على الشريحة غير الملطخة المقابلة ، بالإضافة إلى الأنابيب الدقيقة المصنفة مسبقا والتي تحتوي على مخزن الهضم العازل لجمع الأنسجة في متناول اليد. قم بتحميل الشرائح غير الملطخة في رف وانتقل إلى غطاء الدخان لإزالة البارافينات.

قم بإزالة الشرائح عن طريق غمر الشرائح في غسلتين متتابعتين من D-limonene أو CitriSolv غير المخفف متبوعا بغسل نهائي في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة دقيقتين لكل غسلة. في بداية كل غسلة ، حرك الغسيل بلطف لمدة تتراوح بين خمس و 10 ثوان. لتقليل الترحيل بين الغسولات، اسمح للشرائح بالتصريف لفترة وجيزة وربت الرف على المنشفة الورقية.

بعد عمليات الغسيل الثلاثة ، أصبحت الأنسجة الآن مرئية للغاية على شرائح المجهر. اترك الشرائح لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق. بمجرد أن يجف ، يتم وضع H و E وجها لأسفل على المقعد ويتم وضع الأنسجة المنزوعة البارافين في الأعلى ، ووجهها لأسفل أيضا ، واصطفاف الأنسجة المنزوعة البارافين مع H و E.بمجرد محاذاة بشكل صحيح ، يتم تتبع منطقة الورم التي حددها أخصائي علم الأمراض على H و E على الجزء الخلفي من شريحة قسم الأنسجة المنزوعة البارافين.

يتم غمس الشرائح غير الملطخة التي تم وضع علامة عليها الآن في محلول جليسيرول بنسبة 3٪ لتقليل جمع الأنسجة الثابتة والمساعدة. قم بإزالة الشرائح المغموسة ببطء لتقليل كمية محلول الجلسرين الذي يتشبث بالشريحة المغموسة. بمجرد إزالتها، امسح الجزء الخلفي من الشريحة وأي مناطق خالية من الأنسجة في الجزء الأمامي من الشريحة لإزالة الجلسرين الزائد.

بعد ذلك ، باستخدام شفرة نظيفة ، تتبع علامات علم الأمراض مع الشفرة لكسر الاتصال بين الأنسجة ذات الاهتمام وبقية الأنسجة. مع ملاحظة أنه يمكن القيام بهذه الخطوة قبل غمس الجلسرين ، خاصة إذا كانت العلامات المرضية معقدة لأن قطع الأنسجة الجافة يمكن أن يكون أسهل ويمكن أن يقلل أيضا من خطر سحب الأنسجة. الأنسجة خارج علامات علم الأمراض ليست ذات أهمية.

تتم إزالتها باستخدام الحافة المسطحة للشفرة ، مع التأكد من أن زاوية الشفرة تربط خارج علامات علم الأمراض. بمجرد إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها ، يتم استخدام شفرة جديدة لجمع الأنسجة ذات الاهتمام. ثم تتم إزالة الأنسجة التي تم جمعها من الشفرة باستخدام الطرف المسطح لعصا خشبية ثم يتم نقلها إلى أنبوب صغير محدد مسبقا مع مخزن مؤقت للهضم ، وبالتالي إكمال إثراء أنسجة الورم بوساطة التشريح الكلي ، والتي أصبحت الآن جاهزة لاستخراج الحمض النووي.

لتوضيح كيف يمكن أن يؤثر التشريح الكلي على التحليل الجينومي في المراحل النهائية ، تم تشريح أقسام الأنسجة من خمسة أورام ليمفاوية كبيرة منتشرة للخلايا البائية ، أو DLBCL ، مع محتويات الورم المختلفة بشكل كلي أو لم يتم تشريحها بشكل كلي. تم إجراء عمليات استخراج الحمض النووي على الأنسجة التي تم جمعها وفحص الحمض النووي الريبي الناتج باستخدام اختبار تحديد ملامح التعبير الجيني الرقمي DLBCL90 ، والذي يعرف أيضا باسم فحص التوقيع مزدوج الضربة. يتكون DLBCL من ثلاثة أنواع فرعية جزيئية متميزة ، وهي GCB و ABC ونوعهما الفرعي الوسيط الذي يشار إليه بأنه غير مصنف ، والذي يمكن تحديده باستخدام فحص DLBCL90.

هذا الفحص قادر أيضا على تحديد أورام DLBCL التي تؤوي عمليات نقل مزدوجة الضرب تتضمن جين BCL2. تظهر نتائج DLBCL 90 في هذا الجدول. تم تشغيل العينات التي تم تشريحها بشكل كلي مرتين.

مرة واحدة باستخدام تركيز مخزون الحمض النووي الريبي الخاص بهم ومرة واحدة باستخدام مخزون الحمض النووي الريبي المخفف لمطابقة تركيز نظرائهم غير التشريح الكلي. تظهر النتائج أن التشريح الكلي أدى إلى تغييرات في النوع الفرعي أو المكالمة المزدوجة في ثلاث من العينات الخمس. لم يكن للتشريح الكلي للعينة A أي تأثير على استدعاء النوع الفرعي ، ولكنه غير المكالمة المزدوجة من سلبية إلى غير مصنفة ، وقد لوحظ هذا التغيير بغض النظر عن إدخال الحمض النووي الريبي للعينة التي تم تشريحها بشكل كبير.

وعلى النقيض من ذلك، لم يكن للتشريح الكلي للعينة C أي تأثير على المكالمة ذات الضربة المزدوجة، ولكنه غير استدعاء النوع الفرعي من GCB إلى غير مصنف، والذي لوحظ أيضا بغض النظر عن مدخلات الحمض النووي الريبي للعينة التي تم تشريحها بشكل كلي. على غرار العينة A ، لم يكن للتشريح الكلي للعينة E أي تأثير على استدعاء النوع الفرعي ، ولكنه غير المكالمة ذات الضربة المزدوجة. ومع ذلك ، بالنسبة للعينة E ، تغيرت المكالمة من غير مصنفة إلى سلبية ، ومرة أخرى ، فعلت ذلك بغض النظر عن مدخلات الحمض النووي الريبي للعينة التي تم تشريحها بشكل كبير.

ومن الجدير بالذكر أن هذه المكالمة التي تغيرت إلى سلبية مزدوجة الضربة أمر منطقي بيولوجيا بالنظر إلى أنه تم العثور على العينة E لتكون ABC وتم الإبلاغ عن عمليات نقل مزدوجة الضربة التي تنطوي على BCL2 لوحظت حصريا في أورام GCB. وتسلط هذه النتائج مجتمعة الضوء على أهمية نقاء الورم والمقايسات الجينومية والتشريح الكلي كأداة موثوقة لتحقيق ذلك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لماهية التشريح الكلي ، وأهمية المراجعة المرضية وفوائد الدراسة المكتسبة من خلال تضمين التشريح الكلي في سير عمل معالجة الأنسجة.