طريقتان للتقشير لعزل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين للفأر لتحليل البروتين

تعمل تقنيتا التقشير الموجودتان هنا على عزل المقصورات تحت الخلوية الفردية للقضيب ، ويمكن أن تساعد في الكشف عن العمليات الفسيولوجية المهمة التي تحدث في كل حجرة متخصصة في قضبان صحية ومريضة. يمكن أن يكون عزل مقصورات خلايا قضيب مختلفة من شبكية العين الفأر تحديا. تستخدم هذه التقنيات البسيطة مواد مختبرية غير مكلفة وشائعة لعزل المقصورات تحت الخلوية للقضيب بشكل موثوق لتحليل البروتين.

للبدء ، ضع قطعة من ورق الترشيح في طبق بتري مملوء بمخزن Ames HEPES العازل بفقاعات مع أكسجين 100٪. ثم، باستخدام ماصة نقل واسعة التجويف، انقل مستطيلا واحدا من شبكية العين تم تشريحه من ماوس C57 Black 6J عمره شهرين إلى ثلاثة أشهر. قم بتوجيه مقعر شبكية العين المقسمة لأعلى وتأكد من أن المستقبلات الضوئية متجهة لأسفل نحو أسفل الطبق.

ثم، باستخدام ملاقط، أمسك برفق جوانب شبكية العين المقطعة إلى نصفين وحركها فوق ورقة الترشيح. بمجرد توسيط شبكية العين، حرك ورقة الترشيح لأعلى حتى تلمس شبكية العين المقطعة إلى النصف ورقة الترشيح لإنشاء جزء خارجي من القضيب، أو ROS لتصفية التصاق الورق. ارفع ورقة الترشيح بعناية مع شبكية العين المرفقة خارج المخزن المؤقت Ames HEPES.

ضع الجانب السفلي من ورقة الترشيح على منشفة ورقية وربت مرتين إلى ثلاث مرات حتى تجف. أضف قطرة من Ames HEPES على جانب ورق الترشيح مع شبكية العين وضع ورقة الترشيح على منشفة ورقية مرة أخرى حتى تجف. بعد ذلك ، ضع ورقة الترشيح مع شبكية العين مرة أخرى في طبق بتري ، وباستخدام ملاقط ، ادفع بلطف جميع حواف شبكية العين المقطعة إلى النصف لأعلى وبعيدا عن ورق الترشيح من جميع الجوانب.

قشر الشبكية بدقة بعيدا عن ورق الترشيح، مع لمس المحيط الأقصى للشبكية فقط للحفاظ على سلامتها الهيكلية. بعد ذلك ، ارفع ورقة الترشيح من طبق بتري وأزل السائل الزائد على منشفة ورقية ، مما يضمن أن الجانب الملامس لشبكية العين لا يتصل بالمنشفة الورقية. ضع ورقة الترشيح مع طبقة ROS الجزئية في أنبوب ملصق على الجليد ، واحتفظ بالشبكية المقشرة مغمورة في مخزن Ames HEPES المؤقت.

كرر عملية التقشير لهذه الشبكية المقطعة إلى نصفين حوالي سبع إلى ثماني مرات لإزالة طبقة ROS بأكملها. بعد كل تقشير، ضع ورقة الترشيح في نفس الأنبوب لدمج جميع ROS المعزولة من شبكية العين المقطعة إلى نصفين. احتفظ بالأنبوب الذي يحتوي على جميع قشور ورق الترشيح ل ROS المعزول على الجليد للاستخدام الفوري.

باستخدام ملاقط ، انقل الشبكية المقشرة المتبقية إلى أنبوب ملصق بشكل مناسب واحتفظ بالأنبوب على الجليد للاستخدام الفوري. لإعداد عينة الشبكية لتجفيدها، ضع قطعة من ورق الترشيح وانقل شبكية العين المقطعة إلى النصف إلى طبق بتري مملوء بمخزن رينجر البارد. بعد ذلك ، باستخدام ملاقط ، اقلب شبكية العين بعناية بحيث تكون مقعرة وتحركها لتستقر فوق ورقة الترشيح.

ارفع ورق الترشيح من الحواف لأعلى حتى تلامس قطعة شبكية العين المقطعة إلى النصف ورقة الترشيح. استمر في رفع ورقة الترشيح من حل Ringer. ثم ضع الجانب السفلي من ورقة الترشيح على منشفة ورقية وربت بعناية مرتين إلى ثلاث مرات لإزالة السائل الزائد.

بعد ذلك ، التقط ورقة الترشيح باستخدام ملاقط وأضف قطرة من Ringer البارد على جانب ورق الترشيح مع شبكية العين. مرة أخرى ، ضع ورقة الترشيح على منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد. قم بتخزين كل عينة من شبكية العين وورق الترشيح الملتصقة في طبق بتري مملوء بعينات رينجر الباردة حتى تصبح جاهزة لتجميد جميع العينات.

بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، ارفع كل عينة من المخزن المؤقت ل Ringer البارد ، مما يضمن أن الملقط يلامس حواف ورق الترشيح فقط ، وتجنب شبكية العين المقطعة إلى النصف. ضع الجانب السفلي من كل ورقة ترشيح على منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد. ثم ، أضف قطرة من PBS الباردة على جانب ورقة الترشيح حيث يتم التصاق شبكية العين وربت ورقة الترشيح على منشفة الورق مرة أخرى.

ضع جميع قطع ورق الترشيح في طبق بتري ، وباستخدام ورق مناديل خالية من الوبر ، قم بإزالة أي سائل زائد يحيط بورق التصفية. بعد ذلك ، لف الطبق بالكامل بإحكام بورق الألومنيوم وتأكد من تأمين حواف رقائق الألومنيوم وضغطها بسلاسة في الجزء السفلي من طبق بتري. ثقب حفنة من الثقوب من 0.1 إلى 0.2 ملم في غطاء رقائق الألومنيوم.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط معدني ، قم بخفض طبق بتري المغطى بورق الألومنيوم تدريجيا إلى نيتروجين سائل. احتفظ بالعينات في النيتروجين السائل حتى تصبح جاهزة للتجميد. من أجل التجفيد ، ضع طبق بتري المغطى بورق الألومنيوم في قارورة تجفيف بالتجميد وقم بإرفاقه بآلة lyophilizer وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

تجفيد الشبكية لمدة 30 دقيقة. بعد التجفيد ، قم بجمع الجزء الخارجي والداخلي من القضيب عن طريق وضع قطعة صغيرة من الشريط بعناية فوق شبكية العين المجففة بالتجميد وتطبيق ضغط طفيف مع الملقط لضمان ارتباطه بطبقة المستقبلات الضوئية. قم بتقشير الشريط ببطء وتأكد من التصاق كل من ROS و RIS بالشريط.

سيكون هناك فيلم أبيض رقيق على السطح المكسور. هذا هو RIS. لفصل هذا RIS، ضع قطعة أخرى من الشريط وادفع الشريط لأسفل على السطح المكسور.

ثم ، ضع قطعة الشريط مع الطبقة البرتقالية الوردية فقط في أنبوب طرد مركزي دقيق يحمل علامة ROS ، وقطع من الشريط مع الطبقة البيضاء الرقيقة في أنبوب آخر يسمى RIS. بعد ذلك ، باستخدام الشريط ، قم بجمع أنسجة الشبكية المتبقية الموجودة على ورقة الترشيح عن طريق تقشير الطبقة البيضاء السميكة. ثم ضع هذا العزل في أنبوب يحمل اسم OIS.

إذا كنت تستخدم في نفس اليوم ، فقم بتخزين الطبقات المعزولة من شبكية العين المجففة بالتجميد في درجة حرارة الغرفة. في الحيوانات المتكيفة مع الظلام، تطابق توزيع GNAT1 و ARR1 بشكل وثيق مع توزيعات الحالة المظلمة المعروفة، حيث كانت إشارة GNAT1 أقوى بشكل واضح في عزل ROS، وكانت إشارة ARR1 أكثر قوة في عزل ROS. أظهر التقدير الكمي لإشارات GNAT1 و ARR1 اختلافات كبيرة بين ظروف الضوء الداكن ل GNAT1 و ARR1 في عينات ROS و ROS.

في كل من العينات المظلمة والمكيفة مع الضوء ، يتم استبعاد إشارات G beat 5S والسيتوكروم C والأكتين من عينات ROS ، مما يدل على عدم وجود تلوث من الطبقات الخلوية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، كانت إشارة G beta 5L مرئية بوضوح في عينات ROS. أظهر الفحص المجهري الإلكتروني الماسح لأسطح شبكية العين السليمة والمقشرة بالتجميد أنه قبل التقشير بشريط لاصق ، تطابق سطح الشبكية المجمدة بالتجميد السليم بشكل وثيق مع ROS الأسطواني المميز.

بعد تقشير الشريط الأولي ، بدا أن ROS و RIS قد تمت إزالتهما بالكامل ، كما يتضح من الطبقة النووية الموحدة الموجودة على سطح الشبكية المتبقية والمقشرة والمجمدة. أزالت قشور الشريط اللاحقة RIS من السطح الحر للطبقة المقشرة. أظهرت هذه التقنية أيضا أن التفاعل المناعي GRK1 كان الأكثر كثافة في عينات ROS في شبكية العين المعرضة للضوء ، وغائبا في عينات OIS.

وعلى العكس من ذلك، أظهرت عينات ROS و RIS إشارة باهتة ل PKC alpha، والتي لا يتم اكتشافها عادة في ROS أو RIS عن طريق تلطيخ التألق المناعي. وأخيرا، يمكن أن يؤدي تقشير الشريط دون المستوى الأمثل إلى إنتاج عينات ملوثة قليلا. كانت عينة RIS ملوثة ببعض عينات OIS ، مما أدى إلى إنتاج كل من نطاقات G beta 5L و G beta 5S ، وإشارة ألفا PKC أعلى.

يجب توخي الحذر عند تجميد شبكية العين. إذا تم استخدام تقنية التجفيد غير الصحيحة ، فقد تذوب شبكية العين ، مما يجعل عزل الطبقات دون الخلوية المختلفة للقضيب بواسطة شريط مستحيل. وقد سمح استخدام طريقة تقشير الشريط هذه بالاقتران مع qRT-PCR بفصل نسخ المستقبلات الضوئية عن بقية شبكية العين.