كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لفصل الحويصلات خارج الخلية عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة

يمكن أن يسمح فصل الحويصلات خارج الخلية عن السوائل مثل وسائط زراعة الخلايا للباحثين بتوصيف البضائع الدهليزية واستكشاف آليات الاتصال داخل الخلايا. تسمح هذه التقنية بفصل كاف بين المركبات الكهربائية والبروتينات خارج الخلية من وسائط زراعة الخلايا المشروطة التي تكون مباشرة وسهلة الاستخدام. لبدء وضع PBS في حمام مائي 37 درجة مئوية.

راقب قوارير زراعة الخلايا المعالجة بالتونيكاميسين تحت المجهر المركب باستخدام عدسة موضوعية 10 × و 100 ×. تدوين ملاحظات عن أي اختلافات بين القوارير. قم بإزالة الوسط من القارورة وضعه في أنبوب 50 ملليلتر.

ثم الطرد المركزي للأنبوب عند 500 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ونقل الناتانت الفائق إلى أنبوب جديد. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 2000 غرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل الناتان الفائق إلى أنبوب جديد وضع الأنبوب على الجليد.

خذ أربع وحدات ترشيح فائقة القطع سعة 15 ملليلتر ثلاثة كيلودالتون وأضف خمسة ملليلترات من PBS إلى كل أنبوب. قم بتشغيل المرشحات عن طريق الطرد المركزي للوحدات عند 4000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة PBS من الوحدات ، قم بتقسيم supernatant من التحكم والظروف المعالجة إلى وحدتي ترشيح فائقتين تحتوي كل منهما على حوالي 12.5 ملليلتر من الوسائط في كل منهما.

قم بطرد الأنابيب مركزيا عند 4000 جم لمدة ساعة واحدة و 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية أو حتى تتركز الوسائط المركزة أو الارتداد في كل وحدة إلى 250 ميكرولتر أو أقل. انقل الارتداد من وحدتي التحكم إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر ومن الوحدات المعالجة إلى أنبوب آخر. قم بقياس الحجم الإجمالي لل retentate في كل أنبوب جهاز طرد مركزي صغير.

إذا كان الحجم أقل من 500 ميكرولتر ، فأضف 0.22 ميكرون PBS المصفى حتى يصبح الحجم النهائي 500 ميكرولتر. ضع الأنابيب في ثلاجة 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بتشغيل جامع الكسور التلقائي أو AFC.

قم بإزالة العمود من أربع درجات مئوية واسمح للعمود بالإحماء إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة العينات الاحتياطية من الفريزر الذي تبلغ درجة حرارته 80 درجة مئوية تحت الصفر وضعها على الجليد لإذابتها ، أثناء الانتظار ، ضع ثمانية أنابيب تحمل علامة 1.5 ملليلتر في دوار AFC مع أغطية متجهة إلى الداخل. أدخل العمود في AFC مع الباركود المواجه للقارئ واضبط الإعدادات لجمع ثمانية أجزاء من 500 ميكرولتر لكل منها وحجم التخزين المؤقت إلى الوضع الافتراضي.

ثم تحقق من التعليمات التي تظهر على الشاشة لبدء المجموعة. بعد امتصاص المخزن المؤقت للتخزين بالكامل في الجزء العلوي من مصفوفة العمود. ابدأ في مسح العمود بإضافة 15 ملليلتر من PBS إلى العمود.

لا تقم بإضافة PBS في وقت مبكر جدا لأنه سيخفف من المخزن المؤقت للتخزين ويمنع التنظيف الكافي. قبل أن يتم امتصاص جميع 15 ملليلتر من PBS بواسطة المصفوفة ، انقر فوق موافق لوقف التنظيف وإزالة أي PBS المتبقية من أعلى مصفوفة العمود باستخدام ماصة صغيرة. لا تلمس المصفوفة.

أضف 500 ميكرولتر من العينة إلى وسط العمود وانقر فوق موافق لبدء التشغيل. بعد امتصاص العينة بالكامل في المصفوفة ، أضف على الفور ثمانية ملليلترات من PBS إلى العمود. يقوم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم تلقائيا بتبديد حجم الفراغ في وسط الدوار قبل جمع جميع الكسور الثمانية من 500 ميكرولتر لكل منها.

بعد الجري ، قم بإزالة الكسور من الدوار وضعها على الجليد. ثم قم بإزالة حجم الفراغ من وسط الدوار. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من PBS إلى العمود لغسل أي عينة متبقية من العمود.

وبمجرد أن يتم مسح العينة التائبة بالكامل ، أضف 15 ملليلتر من PBS إلى العمود. نظرا لأن المصفوفة تمتص PBS النهائي ، أضف 500 ميكرولتر من 0.5 هيدروكسيد الصوديوم المولي إلى مركز مصفوفة العمود. ثم عندما يتم امتصاص هيدروكسيد الصوديوم ، أضف 30 ملليلتر من PBS إلى العمود واتركه يتدفق.

بمجرد الانتهاء من جميع العينات ، احتفظ بالعمود لاستخدامه لاحقا عن طريق إضافة 15 ملليلتر من 0.05٪ من أزيد الصوديوم إلى العمود. اترك ما يقرب من خمسة ملليلترات من أزيد الصوديوم في الجزء العلوي من مصفوفة العمود. قم بإزالة العمود من الاتحاد الآسيوي لكرة القدم وقم بإرفاق الأحرف الكبيرة العلوية والسفلية قبل وضع العمود عند أربع درجات مئوية للتخزين.

قم ببناء وحدة الترشيح الفائق. احصل على ملليلترين ، ثلاث وحدات ترشيح فائقة القطع كيلودالتون لكل عينة. تتكون كل وحدة من ثلاثة أجزاء ، مخروط ، مرشح وتدفق من خلال اسطوانة.

قم بتسمية كل جزء بشكل صحيح. أضف ملليلتر PBS واحد إلى جزء المرشح وقم بتغطيته باستخدام قطعة المخروط. قم بالطرد المركزي لمخروط وحدة الترشيح الفائق لأعلى عند 3،500 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة PBS المصفى من التدفق عبر الأسطوانة.

اقلب وحدة الترشيح الفائق رأسا على عقب وقم بجهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1000 G عند أربع درجات مئوية لإزالة أي PBS متبقي. اجمع أربعة 500 ميكرولتر من كل جزء وأضفها إلى وحدة الترشيح الفائق. ثم تتزامن أعمدة أجهزة الطرد المركزي لمدة ساعة واحدة ، 45 دقيقة عند 3،500 غرام عند أربع درجات مئوية أو حتى يكون مستوى الارتداد عند 100 ميكرولتر.

قم بإزالة التدفق عبر الأسطوانة وتخلص من التدفق من خلاله. اقلب وحدة الترشيح الفائق رأسا على عقب وقم بجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 1000 XG عند أربع درجات مئوية. انقل ال retentate في المخروط إلى أنبوب 1.5 ملليلتر واجعل حجم العينة إلى 150 ميكرولتر مع 0.22 ميكرون PBS المصفى قبل وضع الأنابيب في ثلاجة 80 درجة مئوية تحت الصفر.

أظهرت كتلة غربية تمثيلية من الكسور الفردية تعبيرا قويا عن CD9 و CD63 و CD81. المخالفات من واحد إلى أربعة مع القليل من التعبير أو بدون تعبير مخالفات من خمسة إلى ثمانية. لم يلاحظ أي تعبير عن GM130 أو الكالنكسين في أي كسر.

كان الألبومين موجودا فقط في الكسور من ستة إلى ثمانية. كما تم تقييم فعالية تركيز أجزاء EV والبروتين. لوحظ التعبير عن CD9 و CD63 في lysates الخلية.

كانت جميع بروتينات CD الثلاثة موجودة في أجزاء EV من عينات التحكم وعينات التونيكاميسين المعالجة ولكن ليس في أجزاء البروتين. كان جين قابلية الورم 101 موجودا في الليزات الخلوية ، ولكن ليس في أجزاء EV أو البروتين. تم ملاحظة GM130 و calnexin فقط في lysates الخلية.

في اللطخة الغربية لوسائط زراعة الخلايا المستنفدة للإكسوسومات ، كانت علامات EV موجودة في محللات الخلايا ولكن ليس في عينات الوسائط. لوحظ تعبير الألبومين في كسور البروتين والحد الأدنى من التعبير في الليزات الخلوية. أظهرت ملاحظات TEM هياكل كروية في أجزاء EV من عينات التحكم والتونيكامايسين المعالجة.

لم يتم ملاحظة هذه الهياكل في أي من أجزاء البروتين من نوع العينة. يكشف تحليل تتبع الجسيمات النانوية عن اختلافات في تركيزات الجسيمات من التحكم والكسور المعالجة في كسور EV مقارنة بالتحكم ، وكانت هناك جزيئات أكثر قليلا في معالجة التونيكامايسين. ومع ذلك ، في كسور البروتين ، تم اكتشاف عدد أقل من الجسيمات بالنسبة إلى المركبات الكهربائية.

من المهم أن يكون لديك نفس حجم العينة للتحكم والحالات المعالجة ، مما يسمح بسهولة مقارنة المركبات الكهربائية من العلاجات المختلفة. بعد فصل EVs عن وسائط زراعة الخلايا الحالة ، يمكننا توصيف محتوى البروتين والحمض النووي الريبي والدهون في الحويصلات باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي البروتيني والدهون الدهنية.