التنميط المكاني الرقمي لتوصيف البيئة المكروية في الورم الدبقي المتسلل بشكل منتشر من النوع البالغ

يوفر التنميط المكاني الرقمي ، أو DSP ، طريقة فعالة لتحديد كمية البروتين الطبقية مكانيا. يمكننا تنفيذه من توصيف تعبير البروتين عبر مناطق متميزة من الورم والبيئة المكروية. الميزة الرئيسية ل DSP هي قدرتها على تعدد الإرسال ، مما يتيح معالجة البيانات عالية الإنتاجية.

بالإضافة إلى ذلك ، توفر القدرة على تحديد مناطق الاهتمام المخصصة بعدا مكانيا لتحليل البيانات. يمكن تطبيق DSP على أي عينة قد يساعد فيها تحديد البروتين مكانيا أو تعبير الحمض النووي الريبي في توضيح عملية مرضية أو فسيولوجية. هذا مهم بشكل خاص في علم الأورام ، حيث قد يرتبط تقلب الهدف الإقليمي بالنمو الخبيث أو الغزو.

سيوضح الإجراء سكوت باليسول ، عالم تكنولوجيا الأنسجة ، وراشيل بارني ، تقني الجينوم. لتحضير الشرائح ، ابدأ بأخذ عدة نوى بقطر 2 ملليمتر من كل خزعة ، ووضعها في كتلة ميكروأري نسيجية واحدة. قطع أقسام أربعة ميكرون من الكتلة ، وتركيبها على الشرائح الزجاجية.

ضع كل شريحة داخل حشية حامل الشريحة ، واحتضنها عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في نظام IHC شبه الآلي ، املأ الحاوية في الموضع الأول ب 150 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت لكل شريحة ، بالإضافة إلى خمسة ملليلتر من الحجم الميت ، واترك الغطاء مفتوحا. املأ نفس الكمية من محلول الحجب في الحاوية في الموضع الثاني.

قم بتحميل درج حاوية الكاشف على الجهاز. حدد العملية IHC، متبوعا بحظر اسم الحل في المربع المنسدل لحقل العلامة. بمجرد الانتهاء من جميع الشرائح ، انقر فوق إغلاق.

ثم انقر فوق طباعة التسميات ، وتحقق من جميع ملصقات الشرائح التي لم تتم طباعتها بعد ، وانقر فوق طباعة. قم بتثبيت الملصقات على أعلى الشرائح. قم بتحميل الشرائح على درج الشرائح ، مع التأكد من أن العينة والملصق متجهان لأعلى.

اضغط على زر LED لخفض الدرج ، واسمح للأداة ببدء المسح الضوئي والتعرف على الشرائح. انقر فوق الزر "ابدأ" لبدء التجربة. عند اكتمال التشغيل ، اضغط على زر LED عندما يومض باللون الأخضر.

قم بإزالة الدرج من الجهاز ، وارفع بلاط الغطاء بعناية من كل شريحة. ضع الشرائح في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد ، وحدد كل قسم من الأنسجة بقلم كاره للماء لإنشاء حاجز كاره للماء.

اصنع محلول أوليجو للأجسام المضادة PC عن طريق إضافة ثمانية ميكرولتر من كل جسم مضاد لكل شريحة واستخدام Buffer W للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 200 ميكرولتر. ثم قم بتطبيق محلول oligo PC للأجسام المضادة على الشرائح واحتضان الشرائح طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، ضع الشرائح في صينية مرطبة ، واغسلها ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في 1X TBST.

بعد التثبيت في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها الغسيل مرتين لمدة خمس دقائق في 1X TBST. أضف صبغة SYTO 13 النووية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بالغسيل مرتين باستخدام 1X TBST. مرر مؤشر الماوس فوق تجميع البيانات في مركز التحكم وحدد جديد أو متابعة تشغيل.

ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الملصق باتجاه المستخدم. قم بخفض مشبك درج الشريحة ، وتأكد من أن الأنسجة مرئية في النافذة الممدودة. أضف ستة ملليلتر من Buffer S.اتبع المطالبات الموجودة في مركز التحكم.

قم بالتكبير/التصغير بين المحاور المختلفة باستخدام منزلقي x وy لتحديد منطقة للمسح الضوئي. حدد مسح ضوئي، واسمح للمسح بالمتابعة حتى يتم تصوير المنطقة المستهدفة المحددة بالكامل. قم بإنشاء صورة 20 مرة.

حدد عائد الاستثمار عن طريق اختيار ثلاثة عائد استثمار دائري متساوي الحجم بقطر 250 ميكرومتر لكل قلب نسيج. وافق على عائد الاستثمار بالنقر فوق الزر "الخروج من مساحة عمل المسح الضوئي". ثم انتظر حتى يشق ضوء الأشعة فوق البنفسجية oligos من الأجسام المضادة.

بعد الانتهاء من عملية أداة التنظيف ، حدد جمع بيانات جديدة لمتابعة الشرائح أو اللوحة الحالية. افتح نافذة اللوحة النهائية بالنقر المزدوج على منطقة أيقونة اللوحة. أدخل رقم حزمة رمز التهجين ، وانقر فوق تحديث.

ثم انقر فوق إنهاء. افصل حامل الشريحة ولوحة التجميع باتباع المطالبات. قم بتخزين الشرائح في TBST ، أو قم بتغطيتها بوسط مائي وغطاء للتخزين طويل الأجل.

أغلق الألواح باستخدام ختم قابل للنفاذ وجفف الفتحات عند 65 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري مع فتح الجزء العلوي. أضف سبعة ميكرولترات من المياه المعالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات واخلطها. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم تدور بسرعة.

قم بإعداد مزيج المخزن المؤقت للمسبار عن طريق اختيار معادلات المسبار R و U المناسبة التي تطبق المعادلة كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف 84 ميكرولترا من مزيج المخزن المؤقت للمسبار إلى كل حزمة كود تهجين. في لوحة تهجين جديدة مكونة من 96 بئرا ، أضف ثمانية ميكرولترات من كل مزيج رئيسي لرمز التهجين في جميع الآبار ال 12 في الصف المشار إليه.

انقل سبعة ميكرولتر من لوحة تجميع DSP إلى البئر المقابلة في لوحة التهجين. ختم الحرارة ، وتدوير اللوحة ، واحتضانها بين عشية وضحاها عند 67 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتبريد الطبق على الجليد ، وقم بإجراء دوران سريع.

قم بتجميع منتجات التهجين من كل بئر في أنبوب شريطي ، مع سحب كل بئر برفق خمس مرات. قم بالدوران لأسفل ، وقم بتحميل أنابيب الشريط في نظام التحليل. على أداة DSP ، احفظ ملف CDF على محرك أقراص USB ، وانقل البيانات إلى المحلل الرقمي.

على الشاشة، اضغط على بدء المعالجة. حدد حساسية عالية متبوعا بالتالي. اضغط على تحديد الكل لعدد الآبار التي تحتوي على عينات ، ثم إنهاء ، متبوعا بالتالي في إشعار البريد الإلكتروني.

ثم انقر فوق ابدأ. بمجرد الانتهاء من محطة التحضير ، أغلق الخرطوشة وانقلها إلى المحلل الرقمي. اضغط على بدء العد.

حدد موضع المرحلة. اضغط على تحميل ملف CDF موجود، وحدد الملف الذي تم تحميله مسبقا. اضغط على تم.

حدد موضع المرحلة مرة أخرى ، واضغط على تم ، ثم ابدأ لتشغيل البرنامج. احفظ ملف ZIP الخاص بملفات تحويل عدد المراسلين من نظام التحليل إلى محرك أقراص USB. أدخل محرك الأقراص في جهاز DSP.

في مركز تحكم DSP ، مرر مؤشر الماوس فوق جمع البيانات ، ثم انقر فوق تحميل الحسابات. حدد ملف ZIP ذي الصلة. انقر فوق السجلات في مركز تحكم DSP.

لعرض عمليات الفحص في قائمة الانتظار، حدد إضافة عمليات المسح المحددة إلى قائمة الانتظار، ثم قائمة انتظار التحليل الخاصة بي. حدد دراسة جديدة من قائمة الانتظار عن طريق التمرير فوق خيار تحليل البيانات في مركز التحكم. تم إجراء تجربة DSP على عينات من الورم الأرومي الدبقي ، وتم تصور النتائج كخريطة حرارية.

تمثل الصفوف أهداف البروتين ، ويتوافق كل عمود مع منطقة الاهتمام. يتم تصوير مستوى التعبير من خلال نطاق ألوان يتراوح من الأزرق ، الذي يظهر تعبيرا منخفضا ، إلى الأحمر ، مما يدل على التعبير العالي. يعكس تباين اللون داخل صف عدم تجانس البروتين الإقليمي ، ويشير إلى ارتباط مكاني محتمل مع تعبير البروتين التفاضلي.

في هذه التجربة ، كان S100 و CD-56 مرتفعين عالميا ، لأنهما علامات عصبية. تشمل العلامات الأكثر تباينا B7-H3 و KI-67 و CD-44 و fibronectin ، والتي من المعروف أنها مرتبطة بانتشار الورم والهجرة وورم خبيث. من بين مجموعة واسعة من الأهداف المرشحة ، يمكن ل DSP تحديد تلك التي تظهر تباينا إقليميا كبيرا.

هذا يضع الأساس للتحقيق في العوامل المرتبطة بالتباين وأهميتها للمرض.