التصوير المتزامن والكشف القائم على قياس التدفق الخلوي لعلامات الشيخوخة الفلورية المتعددة في الخلايا السرطانية الشائخة الناجمة عن العلاج

يمكن لهذه الطريقة توليد صور عالية الدقة بسرعة تسمح بتحليل التوزيع المكاني وتحديد كمية إشارات الفلورسنت داخل الخلايا مع السماح بالتحليل السريع لعينات متعددة. يتم قياس الخلايا باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي المتقدم للتصوير ، والذي يجمع بين السرعة والحساسية والصور التفصيلية أحادية الخلية مع المعلومات المكانية التي تنتج بيانات فريدة لا يمكن توفيرها بواسطة قياس بصريات التدفقات أو الفحص المجهري. إحدى النصائح المهمة هي توفير خلايا كافية لإنشاء إعدادات الأداة ونقوم بتعليق الخلايا عند الكثافة العالية للقياسات.

بصرف النظر عن هذا الحصول على البيانات هو مباشر ومشابه لقياس التدفق الخلوي التقليدي. قم أولا بإنشاء خطوط خلايا DLBCL كما هو موضح في المخطوطة. ثم أضف محلول EdU 10 ملليمولار بنسبة واحد إلى 1000 في مزرعة خلايا DLBCL واحتضن اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات بعد خلط اللوحة عن طريق الهزاز اللطيف.

أخرج الصفيحة بعد الحضانة وأضف محلول كلوروكين 100 مللي مولا إلى تركيز نهائي من 75 ميكرومولار. تخلط عن طريق الهزاز بلطف وتحضن لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 20 ملليمولار C12 FDG إلى تركيز نهائي من 20 ميكرومولار.

بعد الخلط اللطيف ، احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، أضف محلول 100 ملليمولار 2-فينيل إيثيل-بيتا-د-ثيوغالاكتوسيد في واحد إلى 50 لوقف تلطيخ بيتا غال FSA. وقم بتدوير اللوحة بلطف للخلط.

انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 ملليلتر وتدور بسرعة 100 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بمجرد التخلص من المادة الفائقة ، اغسل الخلايا بأربعة ملليلترات من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم أعد تعليق كريات الخلايا في 500 ميكرولتر عند محلول تثبيت بارافورمالديهايد بنسبة 4٪.

بعد 10 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، قم بجهاز طرد مركزي عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة واغسل الخلايا بأربعة ملليلترات من PBS مرتين وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 100 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل ، تخلص من supernatant وأعد تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الصابونين.

الآن انقل التعليق إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اضرب الخلايا عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية واحتضنها عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها، في الظلام.

الطرد المركزي للأنابيب عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبر ناتانت واغسله ب 100 ميكرولتر من محلول غسيل الصابونين. بعد غسل الخلايا مرتين ، تخلص من supernatant وأعد تعليق كريات الخلايا في 500 ميكرولتر من كوكتيل الكشف عن EdU.

احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام وأجهزة الطرد المركزي في 250 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبر ناتانت واغسله بملليلتر واحد من محلول غسل الصابونين. كرر الغسيل مرتين ، وتخلص من supernatant وأعد تعليق كريات الخلايا في 20 إلى 50 ميكرولتر من PBS.

قبل تشغيل الجهاز ، أفرغ زجاجة سائل النفايات وتحقق من مستويات SpeedBeads والمعقم والمنظف ومزيل الفقاعات وغمد السوائل الكافية. بعد تشغيل الجهاز وبرنامج التصوير ، انقر فوق زر بدء التشغيل لتهيئة الموائع ومعايرة النظام. اضبط التكبير على 40 مرة واضبط سرعة الانسيابية على منخفضة.

بعد تشغيل الليزر ، قم بتشغيل ليزر 405 نانومتر لقياس EdU Pacific Blue ، و 488 نانومتر لقياس C12-FDG و 642 نانومتر لقياس Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. قم بتعيين القناة السادسة للقناة المبعثرة والقناة الأولى والقناة التاسعة للحقل الساطع. ثم ابدأ بالعينة المتوقع أن يكون لها أعلى تألق لإعداد شدة الليزر وقلب أنبوب العينة بلطف للخلط.

بعد فتح غطاء الأنبوب، أدخل أنبوب العينة في قفص الاتهام. انقر فوق تحميل لبدء وفتح مؤامرة مبعثرة. بعد ذلك ، حدد منطقة الميزات ، وقم بتسطير MO1 ونسبة العرض إلى الارتفاع تسطير MO1 للمحورين X و Y على التوالي.

قم بتعيين بوابة فوق نسبة العرض إلى الارتفاع تبلغ 0.5 لاستبعاد الثنائيات ومجاميع الخلايا أسفل الجانب الأيمن وعلى الجانب الأيمن ومجموعة SpeedBead على الجانب الأيسر. الآن ، افتح مخطط الرسم البياني وحدد معلم الجذر المتدرج متوسط مربع القناع واحد والقناة الأولى للمحور X. اختر المجموعة السكانية المفردة واضبط البوابة للتحديد للخلايا المركزة.

افتح مخطط الرسم البياني وحدد كثافة البكسل القصوى الخام لقناة المحور X الثانية والسابعة و11. ثم اضبط قوى الليزر لليزر 488 نانومتر و 405 نانومتر و 642 نانومتر للقناة الثانية والسابعة و 11 على التوالي بحيث يكون لكل فلوروكروم قيمة بكسل قصوى خام بين 100 و 4000 لتجنب الإفراط في التشبع. اختر المجموعة المركزة لتسجيلها وانقر فوق اكتساب لقياس عينات DLBCL بإعدادات متسقة.

عند تغيير العينات للقياس ، انقر فوق الرجوع لاستعادة أنبوب العينة. اضغط على تحميل لتجاهل العينة. بعد قياس جميع العينات ، قم بإيقاف تشغيل الليزر الساطع والتشتت.

قم بقياس عينات التحكم بلون واحد لإنشاء مصفوفة تعويض. انقر فوق إيقاف التشغيل لإغلاق نظام التصوير. تحليل البيانات في برنامج تحليل الصور.

استخدم أداة Spot Wizard الخاصة ببرنامج تحليل الصور لحساب بؤر غاما H2AX النووية وصور الخلايا الحية وقياسها كميا تلقائيا. حدد مجموعتين من الخلايا، واحدة ذات عدد نقاط مرتفع والأخرى ذات عدد نقاط منخفض لتدريب معالج البقع على مزيد من التحليل التلقائي لعدد النقاط. أظهرت طريقة قياس التدفق الخلوي في صور الخلية الواحدة زيادة إيجابية C12-FDG ، وسلبية EdU ، وإيجابية غاما H2AX ، وعدد السكان المسنين و KARPAS422.

خلايا WSU-DLCL2 و OCI-LY1 ، ولكن ليس في خلايا SU-DHL6. قدم التحليل القائم على التصوير أعدادا أعلى بكثير من بؤر غاما H2AX و KARPAS422 و WSU-DLCL2 و OCI-LY1 ، ولكن ليس في خلايا SU-DHL6. ومثلت نتائج مماثلة ببيانات التواتر والقياس الكمي.

تعد إضافة الصابونين إلى تعليق الخلية أمرا بالغ الأهمية ، وإلا فلن تتمكن الأجسام المضادة من الوصول إلى المستضدات الداخلية للخلية وتؤدي المنظفات القاسية إلى فقدان إشارة C12-FTG يعد قياس الخلايا التصويري مثاليا لتحليل التغيرات في توطين العلامات مثل نقل عامل النسخ إلى النواة استجابة لبعض المحفزات. يمكن أيضا تحقيق مثل هذا التحليل باستخدام بروتوكولنا. تسمح هذه الطريقة بتصور علامات الفلورسنت المتعددة على مستوى خلية واحدة مما يساعد على اكتشاف وجود الإشارات الفردية وكثافتها وتوطينها.