بروتوكول تطهير فعال لدراسة تطور البذور في الطماطم (Solanum lycopersicum L.)

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في البحث بسرعة ودون عناء في العثور على فترات غير طبيعية لتطور جنين الطماطم. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي معالجة بذور الطماطم مع هيبوكلوريت الصوديوم الذي يوفر أساسا لمراقبة أجنة الطماطم. ابدأ بالتحضير الكيميائي وحصاد ثمار Solanum lycopersicum بعد ثلاثة إلى 23 يوما من الإزهار أو DAF.

ضع الثمار على الجليد على الفور وقسمها إلى ثمار مبكرة ومتوسطة ومتأخرة ، بناء على الأيام التي تلي الإزهار. كسر الفاكهة المبكرة ، ووضعها على شريحة وجمع البذور الطازجة بعناية مع ملقط دقيق تحت 1x إلى 4x تكبير المجهر ستيريو. بالنسبة للفواكه المتوسطة والمتأخرة ، قم بكسر الفاكهة وجمع البذور الطازجة مباشرة باستخدام ملقط دقيق.

في الطريقة التقليدية ، انقل البذور التي تم جمعها حديثا على الفور إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 ملليلتر يحتوي على 1.5 ملليلتر مثبت FAA وضع الأنبوب على شاكر المداري عند 5 دورات في الدقيقة لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. ثم جفف البذور بنسبة 70٪ 95٪ و 100٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة لكل منهما على شاكر مداري عند 5 دورة في الدقيقة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع البذور في ثلاث إلى خمس قطرات من محلول المقاصة الموجود على الشريحة ، وقم بتغطيتها برفق بزلة غطاء.

استخدم شريحة مقعرة واحدة للبذور الوسطى والمتأخرة. اعتمادا على المراحل التنموية للبذور ، احتضنها في درجة حرارة الغرفة للتطهير. بعد الحضانة ، راقب العينات ذات تباين التداخل التفاضلي ، أو مجهر DIC المجهز بكاميرا رقمية بتكبير 10x و 20x و 40x.

اضبط وحسن سطوع الضوء المرسل وشريط تمرير DIC وفتحة المكثف في الوقت الفعلي لكل عينة والتقاط الصور. انقل البذور الطازجة التي تم جمعها من الثمار المكسورة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 ملليلتر يحتوي على 1.5 ملليلتر من محلول مطهر. احتضان العينات على شاكر مداري عند 30 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث إلى 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد أن يصبح مخطط طبقة البذور الأعمق مرئيا بوضوح ، تخلص من محلول المطهر. بالنسبة للبذور المتوسطة والمتأخرة ، انقل البذور إلى شريحة. استخدم ملقط وإبرة تشريح لإزالة صمغ البذور تحت تكبير 1x إلى 4x لمجهر الاستريو.

نقل البذور مرة أخرى إلى أنبوب الطرد المركزي الأصلي باستخدام ملقط. اغسلها خمس مرات في 1.5 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات لمدة 10 ثوان لكل منها ، وتخلص من الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، أضف الحجم المزدوج لمحلول المقاصة إلى البذور.

اعتمادا على مرحلة البذور ، أعط المعالجة الفراغية المتقطعة لمدة صفر إلى 50 دقيقة ، مع فترات 10 دقائق بعد كل معالجة فراغية لمدة 10 دقائق. بعد المعالجة الفراغية ، استبدل محلول المقاصة. لتسهيل إزالة البذور ، ضع أنبوب الطرد المركزي المحمي من الضوء لمدة 30 دقيقة إلى سبعة أيام في درجة حرارة الغرفة.

في حالة الأجنة المتأخرة ، استبدل المحلول يوميا بمحلول إزالة جديد ، متبوعا بإخضاع البذور للمعالجة الفراغية لمدة 10 دقائق. ضع البذور التي تم تطهيرها على الشريحة أو شريحة مقعرة واحدة. باستخدام مجهر DIC المجهز بكاميرا رقمية ، قم بضبط وتحسين سطوع الضوء المرسل وشريط تمرير DIC وفتحة المكثف في الوقت الفعلي لكل عينة والتقاط الصورة.

في الطريقة التقليدية لإزالة بذور S.lycopersicum ، منعت خلايا السويداء الكثيفة تصور الأجنة المبكرة في 3 و 6 DAF. أدى انخفاض النفاذية أثناء نمو البذور إلى صور غامضة بعد 9 DAF. أصبح صمغ البذور ومعطف البذور تدريجيا أكثر كثافة ، مما منع تغلغل عوامل التطهير من 13 DAF فصاعدا.

كان مخطط الجنين داخل 14 إلى 19 بذرة DAF غير واضح للغاية ، على الرغم من وقت العلاج الممتد لمدة سبعة أيام. كان الهيكل الداخلي في 22 بذرة DAF غير مرئي تماما. كان صمغ معطف البذور المجرد الذي تنتجه خلايا البشرة المغطاة بالبذور بارزا من 13 DAF فصاعدا.

مكنت معالجة هيبوكلوريت الصوديوم من تحديد واضح لطبقة البذور الداخلية وانفصال معظم الصمغ الملتصق دون تلف البذور. في بروتوكول المقاصة الأمثل ، أظهرت البذور شفافية مرضية في جميع مراحل النمو المختبرة. لوحظت طبقات الخلايا المميزة لمعطف البذور عند 3 DAF ، وخلايا السويداء المميزة عند 5 DAF ، والجنين على شكل عصا عند سبعة DAF ، والمرحلة الكروية عند 9 DAF ، ومرحلة القلب عند 11 DAF.

في البروتوكول الأمثل ، تم التقاط درجة تجعيد النبتات وإطلاق النار على meristem القمي بسهولة شديدة في مراحل مختلفة من التطور الجنيني. يزيل التعقيم صمغ البذور وصبغة معطف البذور ، مما يعزز تغلغل البذور وتصورها. يمكن أن تؤدي المعالجة الفراغية إلى تسريع تغلغل محلول التطهير.