Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

تتغلب الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة داخل مركبات SHAPE على قيود التصنيع الحيوي التقليدية لتمكين الزخرفة الدقيقة للأنسجة الحساسة ميكانيكيا داخل الهلاميات المائية التي تشبه البيئة الأصلية خارج الخلية. يعتمد صندوق أدوات SHAPE على تصميم المواد الحيوية المعيارية ، مما يسمح بإجراء تغييرات سهلة في صياغة دعم الطباعة. كما أنه يستفيد من المواد منخفضة التكلفة والمعدات التي يمكن الوصول إليها للتكيف البسيط من قبل مجموعات البحث الأخرى.

يمكن تطبيق هذا النهج لإنشاء نماذج أنسجة عصبية بشرية محددة مكانيا لفحص تطور الخلايا العصبية والتواصل في الاضطرابات التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون. ابدأ بتحضير محلول كربونات الكالسيوم في ماء فائق النقاء بتركيز ملليغرام لكل ملليلتر. امزجه مع محلول الجينات بنسبة متساوية وحركه مغناطيسيا عند 650 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف حمض الخليك إلى هذا الخليط بنسبة واحد إلى 500 وحركه مرة أخرى طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتجزئة محلول الجينات الهلامي ميكانيكيا إلى جسيمات دقيقة عند 15،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق باستخدام الخالط. ثم أجهزة الطرد المركزي للحصول على الجسيمات الدقيقة.

تخلص بعناية من المادة الطافية وأعد تعليق الجسيمات الموجودة في DMEM ، التي تحتوي على اثنين من هيدروكسيد الصوديوم الملي مولار و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. يجب أن يتغير لون التعليق مرة أخرى إلى اللون الأحمر. احتضان التعليق بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.

بعد الحضانة ، قم بتجانس التعليق لمدة ثلاث دقائق عند 15،000 دورة في الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي عند 18،500 جم لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية ومراقبة الحبيبات بحثا عن جزيئات الجينات الدقيقة المعبأة بإحكام. لتوليد مركب SHAPE ، امزج حبيبات الجسيمات الدقيقة للجينات مع الكولاجين المخفف والمحايد بنسبة اثنين إلى واحد وماصة لأعلى ولأسفل على الجليد.

انقل المادة المركبة المتولدة إلى صفيحة بئر مبردة 24. قبل الطباعة ، افصل الخلايا الجذعية العصبية البشرية المزروعة سابقا أو hNSCs باستخدام محلول التربسين 0.025٪ لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم تحييد التربسين مع وسط النمو وأجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 400 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من وسط النمو. باستخدام إبرة معدنية حادة قياس 21 ، قم بتحميل 100 ميكرولتر من جزيئات الجينات الدقيقة المعبأة بإحكام في المحقنة. ثم قم بتحميل تعليق الخلية المعدة في حقنة.

للطباعة ، استبدل إبرة التحميل بإبرة معدنية حادة قياس 27. باستخدام البرنامج المرجعي ، بمجرد تصميم الهيكل المراد طباعته ، انقر فوق إنشاء لإنشاء كود G. أدخل المحقنة المحملة بالخلية في رأس بثق حجمي على طابعة حيوية قائمة على البثق وسجل طول الإبرة بالنقر فوق بدء عملية قياس طول الإبرة.

ثم ضع لوحة البئر 24 المحملة بمركب SHAPE على الطابعة ، وانقر فوق SHM لقياس ارتفاع سطح البئر الفارغ. حدد الرقم الهيدروجيني 2 متبوعا برمز مفتاح الربط. ثم ضمن مجموعة المعلمات ، قم بتغيير معدل تدفق الصوت إلى 3.6 ميكرولتر في الثانية واضغط على تطبيق المعلمة ، متبوعا بحفظ وتم.

قم بتحميل رمز G في واجهة مستخدم الطابعة بالنقر فوق رمز لفتح رمز G. حدد رمز برنامج التشغيل لبدء إجراء الطباعة. مباشرة بعد الطباعة ، احتضان جل SHAPE عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للصلب.

ثم أضف وسط النمو برفق إلى دعم جل SHAPE الملدن. للتلطيخ المناعي ، قم بإزالة الوسط الزائد من الجل ، وباستخدام ملعقة ، انقل الجل إلى حاوية تحتوي على DPBS. بمجرد وضع اللوحة في غطاء الدخان ، قم بإزالة DPBS.

غطي الجل بمحلول فورمالديهايد 4٪ واحتضانه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل باستخدام DPBS ، أضف محلول الحظر إلى الجل. هز الطبق برفق واحتضانه لمدة ست ساعات في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد.

بمجرد إزالة محلول الحجب ، أضف الجسم المضاد الأساسي إلى الجل وهزه برفق. احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد غسل DPBS ، تعامل بالمثل مع الجل بمحلول الأجسام المضادة الثانوي لمدة 24 ساعة.

ضع الجل الملون بملعقة في صفيحة بئر ذات قاع تصوير رفيع قبل التصوير. في الدراسة الحالية ، طبع حبر hNSC خيطا من الخلايا يبلغ قطرها حوالي 200 ميكرومتر. كانت الخيوط المطبوعة غنية بالخلايا القابلة للحياة مع مورفولوجيا حولها.

بعد 30 يوما من الطباعة ، أظهرت الخلايا مورفولوجيا عصبية مع أجسام خلايا صغيرة وعمليات رفيعة طويلة ، مما يشير إلى التمايز الناجح ل hNSCs. سمح تلطيخ مع توبولين بيتا ثلاثة تصور الشبكات العصبية التي تم إنشاؤها مع الحفاظ على الهندسة. وأثناء عملية التمايز، لم تهاجر الخلايا من الخيوط المطبوعة.

يمكن استخدام مركب SHAPE لإنتاج قنوات قابلة للانصهار عن طريق طباعة الحبر القرباني بدلا من الخلايا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يشمل الدعم حبات حساسة للأكسجين لمراقبة توتر الأكسجين في الهياكل المطبوعة 3D عبر الزمان والمكان.