اضطراب جيني عالي الكفاءة في البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم باستخدام مجمعات Cas9-sgRNA الكهربائية
أغسطس 4, 2023
يصف هذا البروتوكول إجراء تحرير الجينوم في البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر باستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي Cas9-sgRNA المجمعة في المختبر وتسليمها عن طريق التثقيب الكهربائي.
يدرس مختبرنا التفاعل بين المتفطرة والسل والجهاز المناعي المضيف ، مع التركيز على التفاعل الأولي بين البكتيريا والبلاعم. هناك مجموعة متنوعة من تقنيات تعطيل الجينات المستخدمة في البلاعم ، بما في ذلك تقنيات RNAi وتقنيات CRISPR. أحد التحديات الرئيسية هو انخفاض كفاءة اضطراب الجينات في البلاعم.
يتيح هذا البروتوكول المعالجة الجينية السريعة وعالية الكفاءة للبلاعم الأولية دون الحاجة إلى الاستنساخ وبناء البلازميد. يجب أن تكون هذه الطرق قابلة للتطبيق على نطاق واسع في علم المناعة ، مما يمكن الباحثين من تعطيل الجينات في الضامة الأولية لمجموعة واسعة من الدراسات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لتحرير الجينوم في البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر باستخدام معقدات البروتين النووي الريبوزي Cas9-sgRNA. ويعزز هذا النهج من كفاءة التلاعب الجيني في البلاعم الأولية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم المناعة
- الهندسة الوراثية
- بيولوجيا الخلايا البلعمية
خلفية علمية
- تلعب الخلايا البلعمية دوراً محورياً في الاستجابة المناعية.
- تعد تقنيات تعطيل الجينات حيوية لدراسة وظائف الخلايا البلعمية.
- غالباً ما تعاني الطرق التقليدية من انخفاض الكفاءة.
- يعالج هذا البروتوكول هذه التحديات من خلال تمكين التلاعب الجيني عالي الكفاءة.
الغرض من الدراسة
- لتحسين كفاءة تعطيل الجينات في البلاعم الأولية.
- لتسهيل التعديل الوراثي السريع دون الحاجة إلى الاستنساخ.
- لتوفير طريقة قابلة للتطبيق في مختلف الدراسات المناعية.
الطرق المستخدمة
- تجميع معقدات البروتين النووي الريبوزي Cas9-sgRNA في المختبر.
- توصيل هذه المعقدات عبر التثقيب الكهربائي.
- تحديد معاملات محددة للتثقيب الكهربائي (على سبيل المثال، 1,900 فولت، 20 ميلي ثانية).
- التطبيق على الخلايا البلعمية الأولية المشتقة من نخاع عظام الفئران.
النتائج الرئيسية
- إثبات كفاءة عالية في تعطيل الجينات داخل الخلايا البلعمية.
- تمكين التلاعب الجيني السريع دون الحاجة إلى البلازميدات.
- إظهار إمكانية تطبيق واسعة لمختلف الأبحاث المناعية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة للتعديل الوراثي في الخلايا البلعمية.
- ويعالج هذا البروتوكول التحديات السابقة المتعلقة بكفاءة تعطيل الجينات.
- يمكن للباحثين استخدام هذه الطريقة في دراسات متنوعة في علم المناعة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يعالج التعطيل الفعال للجينات في البلاعم المشتقة من نخاع العظم الأولي (BMDMs) عقبة حرجة في عملية اكتشاف الأدوية التي تركز على علم المناعة، وذلك من خلال تمكين إجراء أبحاث الجينوم الوظيفية السريعة وعالية الموثوقية في الخلايا الأولية ذات الصلة بالأمراض. وتدعم كفاءة التحرير العالية وسير العمل المبسط في هذا البروتوكول التحقق القوي من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية عند نقاط التحول المبكرة في مرحلة الاكتشاف. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية لفرز محفظة الأدوية ويسرع ترجمة الرؤى الجينية إلى فرضيات علاجية قابلة للتنفيذ.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء المباشر لوظيفة الجينات في البلاعم الأولية، مما يدعم تقليل المخاطر الآلية.
- يسهل التحقق السريع من الأهداف العلاجية في نظام ذي صلة فسيولوجياً.
- يدعم دراسات فقدان الوظيفة عالية الموثوقية لتوضيح المسارات.
- يعزز القيمة التنبؤية لقرارات المحفظة اللاحقة.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز أنظمة خلايا أولية تم التحقق من صحتها لعمليات الفرز المظهري اللاحقة.
- يقدم نتائج كمية وقابلة للتكرار لتعطيل الجينات من أجل توحيد المقايسات.
- يتيح سير عمل قابل للتوسع وخالٍ من البلازميدات، وهو مناسب لحملات الفرز التكرارية.
- يدعم التقييم الموثوق لتأثيرات المركبات في الخلايا البلعمية المعدلة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يوائم التلاعب الجيني مع بيولوجيا الخلايا البلعمية ذات الصلة بالمرض لضمان الاستمرارية الانتقالية.
- يسهل تطوير النماذج قبل السريرية باستخدام خلايا أولية ذات تعديلات جينية محددة.
- يقلل من المخاطر البيولوجية من خلال الربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري في الأنظمة الأولية.
- يدعم اكتشاف المؤشرات الحيوية والدراسات الميكانيكية في مسارات أبحاث المناعة.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يدمج سير عمل CRISPR القائم على التثقيب الكهربائي هذا في مراحل الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف، مما يتيح انتقالاً سلسًا إلى تحديد المركبات الرائدة والأبحاث قبل السريرية في المسارات الموجهة نحو المناعة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتحليل المسارات في الخلايا البلعمية الأولية.
- الفحص: يوفر تعطيلاً جينياً كمياً وقابلاً للتكرار لضمان جاهزية المقايسة.
- التحليلات: يتيح قياس كفاءة التحرير بناءً على تسلسل سانجر لمقارنة الحالات.
- البحث الانتقالي: يحافظ على الصلة المرضية من خلال استخدام الخلايا الأولية للدراسات الجينية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يقدم بروتوكولاً موحداً وقابلاً للتطبيق على نطاق واسع للتلاعب الجيني عبر مشاريع علم المناعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة الهدف.
- القيمة التشغيلية: تبسط سير العمل بكفاءة عالية وقابلية للتكرار، ودون الحاجة إلى بناء البلازميد.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات أسرع بالمضي قدماً أو التوقف، وتخصيص الموارد بكفاءة رأس مالية.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بأصول علم المناعة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الخلايا الأولية وتجميع بروتينات RNP لتقنية CRISPR.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة التثقيب الكهربائي (electroporation) وبنية تحتية لتسلسل سانجر (Sanger sequencing).
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لضمان قابلية التكرار في الدراسات متعددة المواقع.
- قد يكون التكييف ضرورياً لأنواع أخرى من الخلايا الأولية أو الأنواع الحيوية الأخرى.
- يجب التحقق تجريبياً من كفاءة التعديل وحيوية الخلايا لكل جين مستهدف.
