عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى
أكتوبر 13, 2023
يوفر البروتوكول نهجا موثوقا ومحسنا لعزل النوى من عينات الورم الصلبة لتسلسل الجينوم المتعدد باستخدام منصة 10x Genomics ، بما في ذلك التوصيات الخاصة بظروف تفكك الأنسجة ، والحفظ بالتبريد لمعلقات الخلية المفردة ، وتقييم النوى المعزولة.
مع نمو معرفتنا ببيولوجيا الورم واهتمامنا بفهم تعقيدات كيفية تفاعل الخلايا داخل الورم والتأثير على نتائج المرضى ، زادت أيضا أهمية تحليل الخلايا غير المتجانسة عبر البيئة المكروية للورم. يوفر تسلسل Multiome ، الذي يسمح بالحصول على الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وتسلسل الهجوم من نفس الخلية بطريقة خلية مزدوجة ، تقدما كبيرا نحو هذه الغاية. ومع ذلك ، فإن جودة البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجارب تعتمد بشكل كبير على جودة الظروف التجريبية والمواد البيولوجية المدخلة.
يوفر هذا البروتوكول نهجا موثوقا ومحسنا لعزل النوى من عينات الورم الصلبة لتسلسل multiome باستخدام منصة 10x Genomics. هذا البروتوكول موثوق به باستخدام معلقات خلية واحدة طازجة أو مجمدة. نحن نقدم توصيات لظروف تفكك الأنسجة ، والحفظ بالتبريد لمعلقات الخلية المفردة ، وتقييم النوى المعزولة.
في هذا البروتوكول ، استخدمنا عينات الورم الغدي القنوي البنكرياسي البشري ، والتي تعد نوعا أوليا من الأنسجة في مختبرنا. يمثل سرطان البنكرياس نوعا من الأورام شديدة التنسج ، والتي تنذر بأنسجة لزجة نسبيا وكذلك خلايا. علاوة على ذلك ، نظرا لأن عينات أورام البنكرياس المتاحة للبحث تميل أيضا إلى أن تكون صغيرة نسبيا ، يتم بذل الجهود لزيادة كمية الخلايا التي تم التقاطها.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة موثوقة ومحسنة لعزل النوى من عينات الأورام الصلبة لإجراء تسلسل الأوميكس المتعدد (multi-om sequencing) باستخدام منصة 10x Genomics. ويتضمن توصيات بشأن ظروف تفكيك الأنسجة والحفظ بالتجميد لمعلقات الخلايا المفردة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- علم الجينوم
خلفية علمية
- يعد فهم بيولوجيا الأورام أمراً بالغ الأهمية لتحسين نتائج المرضى.
- تزداد أهمية تحليل الخلايا غير المتجانسة في البيئة الدقيقة للورم.
- يتيح التسلسل متعدد الأوميات (Multi-om sequencing) الحصول المقترن على تسلسل RNA وATAC للخلية الواحدة.
- تعتمد جودة البيانات بشكل كبير على الظروف التجريبية والمادة البيولوجية.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول موثوق لعزل النوى من الأورام الصلبة.
- تحسين جودة بيانات تسلسل الأوميكس المتعددة (multi-om sequencing).
- تسهيل تحليل البيئات الدقيقة للأورام.
الطرق المستخدمة
- عزل النوى من عينات الأورام الصلبة.
- استخدام معلقات الخلايا المفردة الطازجة أو المجمدة.
- توصيات بشأن ظروف تفكيك الأنسجة.
- تقنيات الحفظ بالتجميد لمعلقات الخلايا المفردة.
النتائج الرئيسية
- تم وضع نهج مُحسَّن لعزل النوى.
- تم الحصول على نتائج موثوقة من كل من العينات الطازجة والمجمدة.
- تحسين جودة البيانات لتسلسل الـ multi-om.
- تم توفير إرشادات لمعالجة الأنسجة والحفظ بالتجميد.
الاستنتاجات
- يعزز هذا البروتوكول من موثوقية عزل النوى من الأورام.
- يدعم البروتوكول تطوير تقنيات تسلسل الأوميات المتعددة (multi-om sequencing).
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من تحسين الظروف التجريبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يُعد العزل الأمثل للنوى من عينات الأورام الصلبة أمراً بالغ الأهمية لإنتاج بيانات تسلسل متعدد الأوميات (multiome sequencing) عالية الجودة، مما يؤثر بشكل مباشر على موثوقية تحليلات التباين الورمي في علم الأورام الانتقالي. يتناول هذا البروتوكول تحدي استخراج نوى سليمة من أنسجة الأورام التنسجية الليفية (desmoplastic tumor tissues) سواء كانت طازجة أو مجمدة، مما يدعم التوصيف القوي لبيانات الأوميات المتعددة على مستوى الخلية الواحدة. إن التحضير الموثوق للنوى في هذه المرحلة يعزز الثقة التنبؤية في مسارات الاكتشاف وتطوير المؤشرات الحيوية اللاحقة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استقصاءً عالي الدقة لعدم تجانس الخلايا الورمية على مستوى الخلية الواحدة.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال الحفاظ على مجموعات خلوية متنوعة أثناء عملية العزل.
- يسهل الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال التمثيل الدقيق للبيئة المجهرية للورم.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر تحضيرات نووية موحدة لضمان تكرارية فحوصات تسلسل الملتوم (multiome sequencing).
- يضمن الاتساق الكمي والنوعي في المواد المدخلة لسير العمليات اللاحقة.
- يعزز جاهزية الفحص من خلال استيعاب عينات الأورام الطازجة والمجمدة بالتبريد على حد سواء.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يتماشى مع اكتشاف المؤشرات الحيوية الترجمية من خلال تمكين التوصيف المزدوج لـ RNA وإمكانية وصول الكروماتين.
- يحافظ على الصلة بالمرض من خلال رصد تعقيدات البيئات الدقيقة للأورام الصلبة.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال توحيد جودة المدخلات.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يقع بروتوكول عزل النواة هذا عند نقطة التلاقي بين معالجة الأنسجة وتوليد البيانات متعددة الأوميكس (multiomic)، مما يربط بين سير عمل الاكتشاف المبكر والبحوث الترجمية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تزيد من قوة اختبار الفرضيات من خلال الحفاظ على تنوع الخلايا وسلامتها.
- الفحص: توفر نوى عالية الجودة وقابلة للتكرار لاختبارات تسلسل الملتوم (multiome) القابلة للتوسع.
- التحليلات: تتيح قراءات كمية قوية لمقارنة حالات الخلايا الورمية ومناظر الكروماتين.
- الأبحاث الانتقالية: تسهل مواءمة المؤشرات الحيوية من خلال دعم تحليلات RNA و ATAC-seq المزدوجة للخلية الواحدة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تضع بروتوكولاً موحداً وقابلاً للتكيف لمختلف أنواع الأورام الصلبة وظروف العينات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في بيولوجيا الأورام ودراسات التحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار والقابلية للتوسع عبر عينات الأورام الطازجة والمجمدة.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من مخاطر فقدان البيانات أو إدخال شوائب اصطناعية في مرحلة تحضير العينة.
- تأثير المحفظة: تدعم التقدم المعدل حسب المخاطر في برامج اكتشاف الأورام والبرامج الانتقالية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تفكيك الأنسجة والتعامل مع النوى لضمان الحصول على أفضل إنتاجية وجودة.
- يستلزم الوصول إلى كواشف متخصصة، ومصافٍ خلوية، وأدوات تقييم كمية.
- يقتضي توحيد معايير ظروف الهضم والتحلل بين الفرق البحثية لضمان قابلية تكرار النتائج.
- يجب تكييف الطريقة وفقاً لأنواع الأورام وأحجام العينات المختلفة، وخاصة في الأنسجة التنسجية.
- تعد المراقبة الدقيقة لسلامة النوى أمراً أساسياً لتجنب ظهور شوائب اصطناعية في عمليات التسلسل اللاحقة.
