التبلور وجمع بيانات درجة حرارة الغرفة في الموقع باستخدام مرفق التبلور في Harwell و Beamline VMXi ، مصدر ضوء الماس
مارس 8, 2024
نقدم بروتوكولا لتبلور البروتينات باستخدام مرفق التبلور في مجمع الأبحاث في هارويل وما بعده من جمع بيانات البلورات بالأشعة السينية في الموقع من البلورات داخل الألواح في خط شعاع دايموند متعدد الاستخدامات للجزيئات الكبيرة في الموقع (VMXi). نحن نصف متطلبات العينة وبروتوكولات التبلور وإرشادات جمع البيانات.
إن فهم الهياكل ثلاثية الأبعاد للبروتينات يدعم تصميم الأدوية والتكنولوجيا الحيوية وفهمنا للعديد من الأمراض المختلفة. يحدد VMXI هياكل البروتين دون تبريد بالتبريد ، أقرب بكثير إلى درجات الحرارة الطبيعية. يقيس VMXI أيضا بيانات الحيود من بلورات البروتين بينما لا تزال في ألواح التبلور الخاصة بها ، وتجنب أي ضرر من المعالجة الميكانيكية.
في المستقبل ، نريد حقا استغلال الإنتاجية المذهلة ل VMXI لاستكشاف مجموعات كبيرة من البلورات لتحديد الكثير من الحالات الهيكلية المختلفة بدلا من البنية الفردية التي يحصل عليها الناس غالبا الآن. نريد أيضا الدفع نحو تطوير الأدوية وإجراء فحص الشظايا وتحسينها داخل ألواح التبلور. نهج جديد يظهر وعدا هائلا.
نظرة عامة
تعرض هذه المقالة بروتوكولاً لبلورة البروتين وجمع بيانات حيود الأشعة السينية البلورية في الموقع (in situ). وتعتمد هذه الطريقة على خط الشعاع VMXi لتحليل بنى البروتينات في درجات الحرارة الطبيعية، مما يعزز فهم سلوك البروتين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- البيولوجيا التركيبية
- علم البلورات
- تحليل البروتين
خلفية علمية
- يعد فهم بنيات البروتين أمراً بالغ الأهمية لتصميم الأدوية وأبحاث الأمراض.
- غالباً ما تتضمن الطرق التقليدية التبريد العميق، والذي يمكن أن يغير حالات البروتين.
- يتيح نظام VMXi جمع البيانات مباشرة من أطباق البلورة.
- يقلل هذا النهج من التلف الناتج عن المناولة الميكانيكية للبلورات.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لبلورة البروتين بكفاءة.
- الاستفادة من قدرات VMXi لإجراء تحليل بنيوي عالي الإنتاجية.
- استكشاف حالات بنيوية متعددة للبروتينات للحصول على رؤى أدق.
الطرق المستخدمة
- بلورة البروتينات في أطباق NC2.
- استخدام نظام ISPyB لإدارة المقترحات والشحنات.
- جمع البيانات باستخدام خط الشعاع VMXi عند 20 درجة مئوية.
- التصوير والتحليل الآلي لقطرات البلورة.
النتائج الرئيسية
- الجمع الناجح لبيانات الحيود دون الحاجة للتبريد العميق.
- تحديد الأجسام البلورية باستخدام تقييم CHiMP.
- الإدارة الفعالة لمجموعات العينات وعمليات جمع البيانات.
- تعزيز الإنتاجية لاستكشاف هياكل بروتينية متنوعة.
الاستنتاجات
- يسهل هذا البروتوكول عملية بلورة البروتينات وتحليلها بإنتاجية عالية.
- يوفر نهج VMXi مزايا كبيرة مقارنة بالطرق التقليدية.
- تعد هذه الطريقة واعدة لتطوير الأدوية وأبحاث البيولوجيا الهيكلية في المستقبل.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
تتيح تقنية علم البلورات في الموضع (in situ crystallography) عند درجة حرارة الغرفة في VMXi استقصاءً بنيوياً سريعاً وعالي الإنتاجية للبروتينات، مما يدعم المراحل المبكرة من اكتشاف الأدوية وتقليل المخاطر الميكانيكية. ويقلل الجمع المباشر للبيانات من ألواح البلورة من الشوائب الناتجة عن مناولة العينات، كما يسرع من الحصول على نتائج عملية البلورة، مما يعزز الثقة التنبؤية في البحث والتطوير القائم على البنية. وقد صُمم هذا المسار لتبسيط عملية التحقق من الأهداف والفحص القائم على الشظايا، مع توفير وصول عن بُعد عالمي لدعم تطوير المحافظ الدوائية على نطاق المؤسسات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يُمكّن من إجراء التحليل التركيبي المباشر للبروتينات في درجات حرارة قريبة من الظروف الفسيولوجية للتحقق من الأهداف الوظيفية.
- يدعم الاختبار السريع للفرضيات من خلال تقديم تغذية راجعة فورية حول حالات التبلور وارتباط الربيطة.
- يُسهّل تقليل المخاطر الآلية عن طريق رصد حالات تشكيلية متعددة عبر مجموعات البلورات.
- يعزز الثقة التنبؤية في تصميم الأدوية اللاحق من خلال تقليل الشوائب الناتجة عن التبريد العميق.
الفحص وتطوير المقايسة
- تجهيز أنظمة بلورة مُصادق عليها لفحص الشظايا وتحسينها داخل الأطباق.
- توحيد سير عمل التصوير وجمع البيانات باستخدام تحديد البلورات الآلي المعتمد على تعلم الآلة.
- تمكين مخرجات هيكلية كمية وقابلة للتكرار لتقييم المركبات بشكل موثوق.
- التوسع ليشمل الفحص عالي الإنتاجية من خلال الحصول على البيانات القائم على نظام الانتظار ودمج البيانات آلياً.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يوائم جمع البيانات الهيكلية مع الظروف ذات الصلة بالمرض عن طريق تجنب الشوائب الناتجة عن التبريد الشديد.
- يحافظ على الاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال دعم علم البلورات المتسلسل.
- يوفر تقدماً معدلاً وفقاً للمخاطر من خلال تمكين التقييم السريع لارتباط اللجين وديناميكيات البروتين.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تدمج هذه الطريقة المراحل بدءاً من الاكتشاف المبكر وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يدعم التصميم القائم على البنية وفحص الشظايا ضمن سير عمل موحد يمكن الوصول إليه عن بُعد.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسرّع من عملية اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تمكين التحديد السريع للبنية الخالية من الشوائب الاصطناعية.
- الفحص: توفر منصات بلورة قابلة للتكرار وجاهزة للمقايسة مع تصوير وجمع بيانات مؤتمت.
- التحليلات: توفر بيانات حيود كمية ودمجاً مؤتمتاً لإجراء تحليل مقارن قوي.
- الأبحاث traslational: تدعم الاستمرارية قبل السريرية من خلال التقاط بنيات البروتين تحت ظروف شبيهة بالحالة الطبيعية.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: توفر بنية تحتية قابلة للتوسع ويمكن الوصول إليها عن بُعد لحملات بنيوية متكررة عبر البرامج المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة الهدف.
- القيمة التشغيلية: توحد وتؤتمت سير عمل التبلور والتصوير وجمع البيانات.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات أسرع بشأن المضي قدماً أو التوقف، وتضمن تقدماً فعالاً للمحفظة من حيث رأس المال.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والتقدم السريع للأهداف التي تم التحقق من بنيتها.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في بلورة البروتين وتفسير بيانات البيولوجيا البنيوية.
- يتطلب الوصول إلى التصوير الآلي، وتحديد البلورات القائم على التعلم الآلي، والبنية التحتية لخطوط شعاع السينكروترون.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لتتبع العينات، وإدارة البيانات، وبروتوكولات الوصول عن بُعد.
- قد يتطلب التكيف مع مختلف البروتينات المستهدفة وظروف البلورة تحسيناً للبروتوكول.
- تعتمد الإنتاجية وجودة البيانات على تحضير العينات ومدى توافق الأطباق مع الأنظمة الآلية.
