الإنتاج والفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للخلايا الحية متعدد المعلمات (FLIM) للكرويات متعددة الخلايا
أغسطس 9, 2024
هنا ، نصف طرق تكوين كروية متعددة الخلايا مختلفة لإجراء الفحص المجهري للخلايا الحية متعدد المعلمات للمتابعة. باستخدام المجهر التصويري مدى الحياة الفلوري (FLIM) ، والتألق الذاتي الخلوي ، والأصباغ الملطخة ، والجسيمات النانوية ، يتم إثبات نهج تحليل استقلاب الخلايا ، ونقص الأكسجة ، وموت الخلايا في السرطان الحي ثلاثي الأبعاد (3D) والأجسام الكروية المشتقة من الخلايا الجذعية.
في هذا العمل ، نقدم ونقارن طرق تكوين كروية يمكن استخدامها لتحليل استقلاب الخلية وتوزيع الأكسجين باستخدام المجهر الخلوي الحي. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة على نطاق واسع للتحقيق في المؤشرات الحيوية الأيضية مثل NADPH و FAD في الخلايا الحية ، وتم تطوير العديد من الجسيمات النانوية الفلورية لتعدد هذه القياسات مع تصوير أكسجة الخلايا والأنسجة. يمكن للكرويات متعددة الخلايا ، والمواد العضوية ، والأعضاء على رقاقة تكرار بيئة دقيقة معقدة تشبه الجسم الحي ، مما يقلل من الحاجة إلى الأبحاث الحيوانية.
بالنسبة لإنتاج الكرة الأرضية ، نعرض طرق تشكيل مختلفة ، يمكن أن تمتد من إنتاجية منخفضة إلى عالية. كما أنها تسلط الضوء على إمكانية الوصول البصري ، والتوافق مع مجهر التصوير مدى الحياة الفلوري ، وإمكانية تضمين مكونات مصفوفة خارج الخلية. لذلك ، على الرغم من أن نماذج 3D في المختبر توفر سياقا أفضل مقارنة بثقافات 2D ، إلا أن تقلبها العالي ، وقابلية التكاثر المنخفضة ، والتقارير التجريبية غير المكتملة لا تزال تمثل مشكلة.
يمكن أن تؤدي معلمات مثل حجم الكرة ، وتكوين المغذيات ، واللزوجة خارج الخلية ، وحتى طرق تكوين الكرة إلى زيادة عدم التجانس الخلوي. من خلال هذا البروتوكول ، نهدف إلى تنسيق وتوحيد طرق إنتاج الكرة ، وتسليط الضوء على الجوانب الرئيسية المهمة للتحليل المستمر للحياة ومتعدد المعلمات للكرويات باستخدام مجهر FLIM.
نظرة عامة
تستعرض هذه المقالة طرقاً متنوعة لتشكيل كرويات خلوية متعددة الخلايا لتحليل عملية التمثيل الغذائي للخلايا وتوزيع الأكسجين باستخدام مجهر الخلايا الحية. وتسلط الدراسة الضوء على استخدام مجهر تصوير عمر الفلورة (FLIM) لاستقصاء المؤشرات الحيوية الأيضية في الخلايا الحية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تصوير الخلايا الحية
خلفية علمية
- تكرر الكرويات متعددة الخلايا والأعضاء العضوية البيئات المجهرية الشبيهة بالأحياء.
- يُستخدم مجهر التصوير بمدى عمر الفلورة لدراسة المؤشرات الحيوية الأيضية.
- تعد التباينية العالية وانخفاض القابلية للتكرار من التحديات في النماذج ثلاثية الأبعاد المختبرية.
- يمكن استخدام طرق مختلفة لتكوين الكرويات لمختلف التطبيقات.
الغرض من الدراسة
- مقارنة طرق تكوين الكريات الخلوية المخصصة للمجهر الخلوي الحي.
- تحليل عملية التمثيل الغذائي للخلايا، ونقص الأكسجة، وموت الخلايا في النماذج ثلاثية الأبعاد.
- تحسين فهم توزيع الأكسجين في الأنظمة متعددة الخلايا.
الطرق المستخدمة
- المجهر التصويري لمدى العمر الفلوري (FLIM)
- تحليل التألق الذاتي الخلوي
- استخدام صبغات التلوين والجسيمات النانوية الفلورية
- تقنيات تكوين الكريات الخلوية المختلفة
النتائج الرئيسية
- طرق مُبرهنة لتحليل التمثيل الغذائي الخلوي في الكريات ثلاثية الأبعاد.
- إثبات توافق الكريات مع تقنية FLIM لإجراء الدراسات الأيضية.
- تسليط الضوء على أهمية مكونات المصفوفة خارج الخلوية في تكوين الكريات.
- معالجة التحديات المتعلقة بقابلية التكرار والتباين في المزارع ثلاثية الأبعاد.
الاستنتاجات
- يمكن لطرق تكوين الكرويات المختلفة أن تعزز تحليل الخلايا الحية.
- يوفر تقنية FLIM رؤى قيمة حول العمليات الأيضية في النماذج ثلاثية الأبعاد.
- يمكن أن يؤدي التطوير المستمر لهذه الطرق إلى تقليل الاعتماد على النماذج الحيوانية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج الإنتاج الموحد وتحليل FLIM متعدد المعاملات للكريات متعددة الخلايا تحديات حرجة في نمذجة البيئات الدقيقة للأورام من أجل اكتشاف الأدوية. إن تنسيق سير عمل تكوين الكريات وتصوير الخلايا الحية يعزز الثقة التنبؤية في القراءات المتعلقة بالتمثيل الغذائي ونقص الأكسجة، مما يدعم اتخاذ قرارات قوية في المراحل المبكرة. يعزز هذا النهج الاستمرارية الانتقالية ويقلل من المخاطر البيولوجية عبر محافظ البحث والتطوير في مجال الأورام والخلايا الجذعية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استقصاء المسارات الاستقلابية وتدرجات الأكسجين في نماذج ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجية.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال قياس المؤشرات الحيوية NADPH و FAD في الكرويات الحية.
- يسهل عملية تقليل المخاطر البيولوجية من خلال قياسات استقلابية وقياسات نقص الأكسجة المتعددة.
- يعزز الثقة التنبؤية فيما يتعلق بالارتباط بالهدف وتعديل المسارات في الأنظمة المعقدة.
الفحص وتطوير المقايسة
- يعد نماذج كروية ثلاثية الأبعاد (3D spheroid) قابلة للتكرار ومتوافقة مع منصات FLIM ذات المجال الواسع والمجهر البؤري ومجهر الفوتونين.
- يوحد ظروف المقايسة لتقليل التباين وتعزيز موثوقية المخرجات الكمية.
- يتيح إجراء مسح عالي الإنتاجية وقابل للتوسيع لتأثيرات المركبات على استقلاب الخلايا وحيويتها.
- يدعم التقييم القوي لتكامل المستشعرات الحيوية والنانوية من أجل قراءات متعددة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يوائم ملفات الأيض ونقص الأكسجة في المختبر مع البيئات الدقيقة للأورام ذات الصلة بالمرض.
- يوفر استمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق من الصلاحية قبل السريرية عن طريق تقليل الاعتماد على النماذج الحيوانية.
- يتيح اتخاذ قرارات تقدم معدلة وفقاً للمخاطر بناءً على بيانات كمية ومتعددة المعايير.
- يسهل تطوير المؤشرات الحيوية الانتقالية باستخدام مخرجات FLIM للخلايا الحية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يدمج سير العمل المنسق هذا المراحل بدءًا من الاكتشاف المبكر وصولاً إلى تحديد المركبات الواعدة والتحقق من الصلاحية قبل السريرية، وذلك من خلال الاستفادة من الإنتاج المعياري للكريات الخلوية وتحليلات FLIM.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات في سياقات ثلاثية الأبعاد تحاكي الظروف الحيوية داخل الجسم.
- الفحص المسحي: تقدم قراءات أيضية وقراءات لنقص الأكسجة كمية وقابلة للتكرار لفرز المركبات.
- التحليلات: توفر قياسات متعددة لمدى عمر الفلورية من أجل مقارنة قوية للظروف.
- البحث الانتقالي: تربط النتائج المخبرية بالنماذج قبل السريرية من خلال إعادة محاكاة سمات البيئة الدقيقة للورم.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لبرامج البحث والتطوير المتنوعة في مجال الأورام والخلايا الجذعية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الآلي في أنظمة النماذج ثلاثية الأبعاد.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع في سير عمل تصوير الخلايا الحية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) وكفاءة رأس المال من خلال توفير بيانات كمية قوية.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بالمرشحين ذوي الصلة البيولوجية التي تم التحقق منها.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، والمجهرية الحية للخلايا، وتحليلات FLIM.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة FLIM ذات المجال الواسع، أو المجهر البؤري، أو مجهر الفوتونين، وبرامج تحليل متوافقة.
- يستلزم توحيد معايير إنتاج الكريات الخلوية وبروتوكولات التصوير بين الفرق المختلفة.
- قد يتطلب التكييف لأنواع مختلفة من الخلايا، أو المصفوفات خارج الخلوية، أو دمج المستشعرات.
- يمكن أن يؤثر التباين في حجم الكريات الخلوية وتكوينها على إمكانية تكرار النتائج وتفسير البيانات.
الأسئلة الشائعة حول المستحضرات الصيدلانية الحيوية
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
