العزل القائم على قياس التدفق الخلوي والتقييم العلاجي للخلايا الليمفاوية المتسللة للورم في نموذج فأر لسرطان البنكرياس

نحن نركز على تطوير طريقة لعزل الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم ، TILs ، ونقلها بالتبني في نموذج سرطان البنكرياس. نحن نحاول الإجابة عما إذا كانت المجموعات الفرعية من TILs يمكن أن تستهدف وتقتل أورام البنكرياس بشكل فعال في الجسم الحي وكيف يمكن تحسين الخلايا التائية للتجارب السريرية المستقبلية. التطورات الحديثة في العلاج بالخلايا بالتبني ، بما في ذلك تعزيز تقنيات عزل TIL والتعبير عنها ، وتعديل TILs بلطف لتحسين استهدافها والجمع بين علاج TIL والعلاجات المناعية الأخرى مثل مثبطات نقاط التفتيش أو العلاجات المستهدفة لتعزيز الفعالية المضادة للأورام.

لقد أنشأنا طريقة قوية لعزل وتوسيع TILs التفاعلية للورم من نموذج فأر سرطان البنكرياس. لقد أظهرنا فعالية معززة مضادة للورم للخلايا التائية التفاعلية للورم المنقولة بالتبني. يقدم بروتوكولنا نهجا أكثر استهدافا للعلاج بالخلايا بالتبني من خلال تمكين عزل واختيار TILs الخاصة بالورم مقارنة بالطرق الأخرى الأقل تحديدا.

كما أنه يستخدم عن طريق التصوير الحيوي لمراقبة الورم غير الغازية. ستعمل النتائج التي توصلنا إليها على تعزيز المجال من خلال توفير نموذج ما قبل السريري الموحد لتقييم فعالية علاج TIL وتحسين معايير العلاج للمجموعات الفرعية للخلايا التائية لسرطان البنكرياس. لتحضير معلق خلية KPC-Luciferase لإحداث ورم بنكرياس تقويم العظام في الفئران ، قم بتربسين خط خلايا KPC-Luciferase لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية.

بعد التربسين ، أضف PBS ، وانقل الخلايا ، ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية. عد الخلايا وأعد تعليقها بتركيز 1 في 10 إلى قوة 6 خلايا لكل مليلتر في PBS تحتوي على 30٪ مصفوفة غشاء القاعد. ضع الماوس المخدر على منصة التشغيل.

بعد إجراء شق في البطن الأيسر من 0.5 إلى 1 سم ، أمسك الطحال باستخدام الملقط وكشف البنكرياس. بعد تحضير خلايا KPC-Luciferase ومزيج مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بحقن 50 ميكرولترا من معلق الخلية الذي يحتوي على 50،000 خلية في البنكرياس باستخدام إبرة قياس 29. أعد البنكرياس إلى تجويف البطن.

خياطة الصفاق والجلد بالتتابع. اسمح للماوس بالتعافي على وسادة دافئة حتى يستيقظ تماما. بعد سبعة أيام ، قم بحقن الفأر داخل الصفاق ب 60 ميكرولتر من محلول ملح البوتاسيوم D-Luciferin للتصوير الحي.

بعد التخدير ، ضع الفأر في نظام التصوير في الجسم الحي للكشف عن التلألؤ البيولوجي. بعد التصوير ، قم بإزالة الماوس من النظام واتركه يتعافى بشكل طبيعي من التخدير. للبدء ، ضع الماوس القتل الرحيم للمتبرع على منصة تشغيل.

تعقيم الجسم كله بنسبة 75٪ من الإيثانول. في غطاء معقم ، استخدم المقص والملقط لفتح تجويف البطن. قم بإزالة الورم ووضعه في PBS على الجليد.

قم بقياس حجم الورم بعيار Vernier. بعد ذلك ، احسب حجم الورم باستخدام الصيغة التي تظهر على الشاشة. بعد تحضير محلول الهضم 1X باستخدام الكولاجيناز و Dispase II و DNAse I في RPMI 1640 ، أضف ملليلترا إلى ملليلترين من المحلول لكل بئر في طبق مكون من 12 بئرا.

افرم الأورام إلى قطع صغيرة باستخدام المقص. انقل قطع الورم إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا وهضمها عند 37 درجة مئوية أثناء الرج عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. لإنهاء عملية الهضم ، أضف ملليلترا إلى ملليلترين من مصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب تجميع.

اغسل آبار الصفيحة المكونة من 12 بئرا مرتين باستخدام PBS لجمع أي خلايا متبقية. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، وقم بفرم وسحق شظايا الأنسجة لتحرير الخلايا المفردة باستخدام الطرف المسطح لمكبس المحقنة. الطرد المركزي المرشح عند 400 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وأعد تعليق الحبيبات في 5٪ ألبومين مصل البقر لتلوين قياس التدفق الخلوي.

للبدء ، ضع الخلايا المعزولة من الفأر الحامل للورم جنبا إلى جنب مع خلايا الطحال أو الدم المحيطي أحادي النواة من الفأر غير الحامل للورم على منصة عمل. تلطخ الخلايا مع حاصرات FC والأجسام المضادة للتدفق عند تخفيف من 1 إلى 100. احتضان الأنابيب على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين في PBS عن طريق الطرد المركزي قبل تعليقها في ألبومين مصل الأبقار بنسبة 1٪ في PBS. على مقياس التدفق الخلوي ، لفرز خلايا CD45 + CD3 + ، قم بتوصيل الخلايا الحية بناء على FSC-A و SSC-A لإنشاء بوابة P1. بعد ذلك ، قم بتوصيل الخلايا المفردة من P1 بناء على FSC-A و FSC-H لإنشاء البوابة P2. قم بفرز خلايا CD45 + CD3 + من P2 باستخدام بوابات CD45 و CD3. اجمع الخلايا التي تم فرزها في أنابيب التجميع.

قامت أجهزة الطرد المركزي بفرز خلايا CD45 + CD3 + عند 400 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في مصل الفأر بتركيز 1 في 10 إلى قوة 6 خلايا لكل مليلتر ، ووضعها على الجليد. ضع الفأر المتلقي الناجم عن الورم على منصة تشغيل.

باستخدام حقنة الأنسولين قياس 29 بوصة 1/2 بوصة ، قم بحقن الخلايا المناعية التي تم فرزها داخل الصفاق بعد ذلك، يتم تطبيق إنترلوكين-2 داخل الصفاق لمدة ثلاثة أيام متتالية.