تطوير نظام بروتوبلاست الملفوف لدراسة تحمل نقص الأكسجة في الكرنب

نحن ندرس كيف يتفاعل الملفوف مع انخفاض الأكسجين على المستوى الجزيئي. نظرا لأنه يصعب الحصول على الملفوف ، فإننا نطور نظاما يستخدم خلايا الملفوف المعزولة. من خلال تعريض هذه الخلايا الاحتياطية ، والمعروفة أيضا باسم البروتوبلاست ، لظروف منخفضة الأكسجين ، يمكننا التحقيق في استجابتها للإجهاد بسهولة.

يعد العمل مع البروتوبلاست المعلق في محلول لدراسة استجابات الأكسجين المنخفضة أمرا صعبا. التحدي الكبير هو الاحتفاظ بما يكفي من الأكسجين لعينات التحكم لدينا. توصلنا إلى طريقة لضخ الأكسجين في السائل.

لقد قمنا بالتحقق من صحة الطريقة من خلال فحوصات المراسل لعلامات نقص الأكسجة. لقد تحققنا من طرق مختلفة للتعامل مع انخفاض الأكسجين ووجدنا أن حزمة امتصاص الأكسجين تعمل بشكل أفضل. إنه سهل الاستخدام وفعال ، مما يجعله رائعا لدراسة كيفية تصرف البروتوبلاست في ظروف الأكسجين المنخفض.

كانت دراسة الآلية الجزيئية في المحاصيل الورقية في ظل ظروف نقص الأكسجة صعبة بسبب محدودية الأدوات المتاحة ، ولكن مع التقدم الأخير ، أحرزنا تقدما كبيرا باستخدام نظام بروتوبلاست الملفوف مع علاج نقص الأكسجة. تساعدنا هذه الطريقة الجديدة على فهم كيفية تأثير انخفاض الأكسجين على هذه النباتات على المستوى الجزيئي. في المستقبل ، نخطط للجمع بين نظام البروتوبلاست مع فحوصات الترسيب المناعي والمراسل لتوضيح المسار التنظيمي الجزيئي الذي ينطوي عليه الملفوف أثناء إجهاد الفيضانات.

هدفنا هو تحديد المنظمين الرئيسيين لتحمل الفيضانات ، والتي نأمل أن نساعد في تربية صنف ملفوف جديد مع تحسين تحمل الفيضانات. للبدء ، املأ الثقوب المستديرة ذات الشكل المربع لصينية سدادة 48 بئرا بركيزة نباتية تجارية وزرع Fuyudori و 228 بذرة ملفوف بعمق سنتيمتر واحد تقريبا في وسط النمو. لتحضير 12.5 مل من محلول الإنزيم ، قم بتسخين محلول يحتوي على 10 ملليمولات MES و 0.6 مولي مانيتول عند 55 درجة مئوية.

ثم أضف 1.5٪ cellulase R-10 و 0.75٪ macerozyme R-10. قلب المحلول واستمر في التسخين على حرارة 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اترك محلول الإنزيم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف 10 مللي مولار كلوريد الكالسيوم و 0.1٪ زلاليم مصل الأبقار. باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر ، قم بتعقيم محلول الإنزيم في طبق بتري بطول تسعة سم. بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من النمو ، اجمع شتلات الملفوف في مرحلة الورقة الثانية لعزل البروتوبلاست المتوسط.

اجمع الأوراق الحقيقية الثانية الموسعة حديثا من خمس إلى ثمانية شتلات ملفوف. باستخدام شفرة حلاقة حادة ، قم بتقطيع الأوراق إلى شرائح من 0.5 إلى 1.0 ملم. انقل شرائح الأوراق على الفور إلى محلول الإنزيم الطازج.

أخضع شرائح أوراق الملفوف للتسلل بالمكنسة الكهربائية في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد التسلل بالفراغ ، احتفظ بشرائط الأوراق مغمورة في محلول الإنزيم في الظلام لمدة أربع إلى 16 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتخفيف المحلول المحتوي على البروتوبلاست بحجم متساو من محلول W5 لوقف الهضم الأنزيمي.

لتحرير تعليق البروتوبلاست ، حرك الخليط برفق على شاكر مداري. ثم قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. جهاز الطرد المركزي لمحلول البروتوبلاست عند 150 جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.

أضف 10 مل من محلول W5 على طول جدار الأنبوب بمعدل تدفق يبلغ حوالي ملليلتر واحد في الثانية لغسل البروتوبلاستات المحببة. بعد آخر طرد مركزي ، أعد تعليق البروتوبلاست في محلول W5 وضع الأنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة ملليلتر واحد من المادة الطافية في كل مرة حتى تتم إزالة كل المادة الطافية.

أعد تعليق البروتوبلاست في محلول MMG مبرد مسبقا بالثلج. قم بقياس تركيز البروتوبلاست باستخدام مقياس كثافة الدم. اضبط التركيز النهائي إلى 4 في 10 إلى قوة 5 بروتوبلاست لكل مليلتر باستخدام محلول MMG.

بعد العزل والهضم طوال الليل ، كان عائد البروتوبلاست 1.04 في 10 أس 7 لفويودوري و 4.00 في 10 أس 6 بروتوبلاست لكل جرام وزن طازج ل 228. كانت كفاءة تعداء البروتوبلاست أعلى من 40٪ في كل من Fuyudori و 228 نوعا ، كما يتضح من جين مراسل GFP. بعد عزل بروتولاست الملفوف ، اخلطي 100 ميكرولتر من 4 مرات 10 إلى قوة 4 بروتوبلاست مع 10 ميكرولتر من البلازميد وضعي الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق.

أضف كمية متساوية من محلول PEG المحضر حديثا إلى محلول البروتوبلاست واخلطه برفق. احتضن خليط البروتوبلاست في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق. ثم أضف 440 ميكرولتر من محلول W5 لإنهاء التفاعل.

جهاز طرد مركزي البروتوبلاستيات المنقولة عند 150 جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 750 ميكرولتر من محلول W5 المخصب بالأكسجين. انقل البروتوبلاستات المعلقة إلى صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار مشفرة مسبقا بألبومين مصل بقري بنسبة 1٪.

لنقص الأكسجة الناجم عن الكيس الذي يستهلك الأكسجين ، ضع صفيحة تحتوي على محلول W5 protoplast في وعاء لاهوائي سعة 3.5 لتر. ثم أضف عبوتين لامتصاص الأكسجين في البرطمان لخلق بيئة ناقصة الأكسجين. بعد العلاج ، قم بالطرد المركزي للبلاستيات البروتوبلاستية عند 150 جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية وقم بتجميد البروتوبلاستات المجمعة في النيتروجين السائل قبل الشروع في فحص اللوسيفيراز المزدوج. تسببت حزمة امتصاص الأكسجين في زيادة 7.0 أضعاف في نشاط محفز BoADH1 مقارنة بعنصر التحكم ، مما يدل على أعلى استجابة لنقص الأكسجة. زاد نشاط مروج BoSUS1L بأكثر من 5.6 أضعاف ، حيث أظهر علاج حزمة امتصاص الأكسجين أكبر تحريض بين العلاجات.