الكشف السريع والمحدد عن عدوى أسينتوباكتر بوماني باستخدام تضخيم بوليميراز إعادة التركيب / نظام قائم على Cas12a

يركز بحثي على أمراض الجهاز التنفسي والعدوى. سأتناول التقنيات الحالية المتقدمة في هذا المجال والفجوات البحثية في مجال المشروع بأكمله. تشمل التقنيات الرئيسية التي نتحدث عنها هنا تسلسل الجيل التالي ، و CRISPR ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، ونماذج تحليل الأعضاء. لديهم شخصية صعبة فيما يتعلق بالتشخيص لأمراض القلب القياسية والعمل والتوصل إلى علاج أفضل. يعالج البروتوكول الخاص بي الحاجة إلى الكشف السريع والمحدد عن Acinetobacter baumannii ، والتغلب على القيود في الأمور التشخيصية الحالية مثل التقنيات التي تستغرق وقتا طويلا والقائمة على الثقافة.

[الراوي] للبدء ، قم بتصميم 12 زوجا من الاشعال باستخدام أدوات تصميم التمهيدي بناء على مبادئ التصميم القياسية. احصل على أربعة بادئات أمامية وثلاثة بادئات عكسية لتكوين 12 زوجا أوليا. قم بتقييم كل زوج تمهيدي من حيث الخصوصية والفعالية باستخدام أداة Primer-BLAST من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية. ثم صمم الحمض النووي الريبي CRISPR أو دليل الحمض النووي الريبي أو gRNA باستخدام تسلسل سقالة LbaCas12a CRISPR RNA كتسلسل ثابت. قم بتضمين مقطع محدد للهدف ، مع التأكد من أن الشكل المجاور للفاصل الأولي أو PAM يقع في الطرف الخمسة الأولي للخيط غير التكميلي. لبناء البلازميد المؤتلف الإيجابي ، قم أولا بتضخيم مقطع Acinetobacter baumannii 16S rDNA باستخدام مجموعات التمهيدي الأمامية والعكسية. قم بإعداد مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل سعة 50 ميكرولتر كما هو موضح على الشاشة. اضبط شروط دورة PCR على جهاز PCR. بعد تنقية منتج PCR الإيجابي ، قم باستنساخه في ناقل PUC57 الذي تم هضمه باستخدام إنزيمات BamHI و SalI. قم بتخفيف البلازميد المؤتلف الإيجابي بشكل متسلسل بزيادات عشرة أضعاف بالماء المقطر المزدوج المعقم. قم بتخزين البلازميد المخفف عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من التجارب. بعد ذلك ، امزج معا عازلة الإماهة الخالية من التمهيدي ، والبادئات الأمامية والخلفية من A. baumannii ، والماء المقطر المزدوج إلى حجم نهائي يبلغ 465 ميكرولترا. دوامة وتدوير الخليط لفترة وجيزة قبل نقله إلى أنابيب تفاعل الإنزيم من مجموعة RPA. تخلط جيدا وتضاف 25 ميكرولترا من أسيتات المغنيسيوم 280 ملليمول. بعد ذلك، قم بتعبئة ماصة ميكرولتر واحد من البلازميد المؤتلف الموجب، الذي يحتوي على 10 نسخ لكل ميكرولتر إلى المحلول A بأزواج أولية مختلفة. احتضان المحلول عند 39 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتنقية المنتجات المضخمة باستخدام مجموعة تنقية RPA. قم بتشغيل المنتج المنقى على جل الاغاروز 1٪ عند 120 فولت لمدة 10 دقائق لتحديد زوج التمهيدي بالنطاق الأكثر سطوعا وأوسع. لتحسين نظام تضخيم RPA، حافظ على تركيزات جميع مكونات التفاعل الأخرى ثابتة مع ضبط الحجم النهائي للمحلول A إلى 465 ميكرولترا. ثم أضف كميات مناسبة من الماء المقطر المزدوج الخالي من الحمض النووي الريبي للحصول على تركيزات أولية نهائية كما هو معطى واحتضانها. بعد تنقية منتج RPA وتعقيده بالكهربية ، حدد التركيز الأمثل للتمهيدي ووقت الحضانة من خلال تحليل شدة النطاق وتوزيعه. لتحضير المحلول B ، قم بخلط مراسل الحمض النووي أحادي الشريطة ، ومخزن تفاعل CAST12a ، و CRISPR RNA CAST12a ، والماء المقطر المزدوج إلى حجم نهائي يبلغ 15 ميكرولترا. أضف خمسة ميكرولترات من تضخيم البوليميراز المعاد تدميره أو منتج RPA في المحلول B. تخلط جيدا حتى تصبح متجانسة. ضع العينات في أداة PCR الكمية الفلورية. لاختبار الخصوصية، احصل على قوالب الحمض النووي من أنواع مختلفة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي المرجعية أو عن طريق غلي البكتيريا في الماء. استخدم الماء كعنصر تحكم سلبي. انقل 10 نانوغرام ، أو ميكرولتر واحد ، من قوالب الحمض النووي إلى المحلول A الذي يحتوي على بادئات أمامية وعكسية. ثم ماصة 25 ميكرولتر من 280 مللي مولار أسيتات المغنيسيوم. تخلط جيدا وتحتضن على حرارة 39 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف خمسة ميكرولترات من ناتج التفاعل إلى المحلول B واخلطه. ضع العينات في أداة PCR الكمية الفلورية. اضبط القناة على FAM واقرأ إشارة الفلورسنت كل دقيقة عند 39 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. لتقييم حساسية منصة الكشف القائمة على RPA-CRISPR CAST12a ، استخدم بلازميد مؤتلف إيجابي مخفف بتركيزات تتراوح من نسخة واحدة إلى 10 نسخ لكل ميكرولتر كقالب للتفاعل. استخدم الماء كعنصر تحكم سلبي. انقل البلازميد إلى المحلول أ ، وأضف أسيتات المغنيسيوم ، واحتضنه كما هو موضح سابقا. بعد الحضانة والنقل إلى المحلول B ، اقرأ علامة الفلورسنتآل. تم تحديد زوج التمهيدي F3-R3 على أنه الأكثر فاعلية لتضخيم البوليميراز المركب ، حيث يعرض النطاقات الأكثر سطوعا وكثافة على الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. تم تحديد التركيز التمهيدي الأمثل للتضخيم ليكون 0.44 ميكرومولار ، وكان وقت التفاعل الأمثل 20 دقيقة. زادت شدة التألق ل CRISPR RNA1 بمرور الوقت ، بينما لم يزد CRISPR RNA2 ، مما أدى إلى اختيار CRISPR RNA1 للكشف عن A. baumannii. أكد تحليل الخصوصية أن A. baumannii كشف نظام الكشف عن A. baumannii DNA حصريا ، مع عدم ملاحظة أي مضان لعينات الحمض النووي البكتيرية الأخرى. يمكن للنظام اكتشاف نسخة واحدة منخفضة لكل ميكرولتر من الحمض النووي ، مما يجعله شديد الحساسية. أكد اختبار شريط التدفق الجانبي الخصوصية العالية لطريقة الكشف ، حيث لم يظهر أي تفاعل متبادل مع الأنواع البكتيرية الأخرى. نجح اختبار A. baumannii في اكتشاف الحمض النووي عبر التخفيفات من 10 نسخ لكل ميكرولتر وصولا إلى نسخة واحدة لكل ميكرولتر ، مما يؤكد قوته تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.