يعمل سير العمل المحسن للتبييض التكراري على توسيع التصوير المتعدد للعينات السريرية عالية الفلورسنت الذاتي

[راوي] باستخدام البروتينات المكانية ، المسماة طريقة Nature Methods لعام 2024 ، يمكن تعيين المواقع الدقيقة للخلايا المناعية جنبا إلى جنب مع تفاعلات الخلايا الخلوية داخل الأنسجة. يكشف هذا عن الأنماط المكانية المرتبطة بالنتائج السريرية. يمثل بناء لوحات الأجسام المضادة المعقدة وأنسجة التصوير ذات التألق الداخلي العالي تحديات كبيرة في الوقت والموارد والخبرة لIBEX وتقنيات الفحص المجهري الفلوري الأخرى. باستخدام IBEX ، تم تحديد السمات الخاصة بالورم في مرضى سرطان الغدد الليمفاوية الجريبية عالية الخطورة ، ومع زملاء Human Cell Atlas. تم إنشاء خريطة مكانية شاملة للغدة الصعترية البشرية. لا يعرف سوى القليل عن تكوين الخلايا المناعية والتفاعلات المكانية واختلافات إنتاج السيتوكين عبر الأمراض الرئوية المتنوعة. هذا البروتوكول يسد هذه الفجوة. يقدم هذا البروتوكول طريقة تشعيع ضوئي منخفضة التكلفة وقابلة للتكيف لتقليل التألق الذاتي للأنسجة واسعة الطيف بشكل كبير ، خاصة في عينات FFPE الصعبة ، مع الحفاظ على إشارة الأجسام المضادة للتحليل المكاني. للبدء ، اغمر الشرائح بالأنسجة في برنامج تلفزيوني بعد الانتهاء من استرجاع المستضد. قم بإزالة شريحة واحدة من PBS واستخدم مناديل خالية من النسالة لتجفيف جميع المخزن المؤقت الزائد بعناية دون لمس الأنسجة. باستخدام قلم كاره للماء ، ارسم حدا حول قسم الأنسجة على الشريحة. بعد تكرار العملية للشرائح المتبقية ، اترك الحواجز الكارهة للماء تجف لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، باستخدام منديل خال من النسالة ، قم بإزالة PBS من قسم الأنسجة دون لمس الأنسجة مباشرة. أضف الآن 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب على الشريحة وأغلق غرفة الرطوبة. ضع الغرفة في ميكروويف علمي غير قابل للتسخين مع آلية تنظيم درجة الحرارة وقم بتشغيل البرنامج المحدد مسبقا خمس دورات. أثناء حضانة الحجب ، قم بإعداد محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولي 1 باستخدام خطافات ومخزن مؤقت مانع يحتوي على كتلة Fc. امزج الأجسام المضادة واخلط الكوكتيل برفق. عند اكتمال دورة الميكروويف ، قم بإزالة حجرة الشريحة وافتحها وقم بإزالة المخزن المؤقت للحجب من الشريحة دون لمس الأنسجة. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية 1 إلى الشريحة. أعد الغرفة إلى الميكروويف وقم بتنفيذ برنامج الأجسام المضادة الأساسي مرة أخرى لمدة 30 دقيقة تقريبا. بمجرد اكتمال وضع العلامات الأساسية على الأجسام المضادة ، أمسك الشريحة عموديا. لغسل الشريحة ، قم بسحب 1,000 ميكرولتر من PBS على الأنسجة ، مما يسمح لها بالجريان. تخلص من PBS الزائد وثبت الشريحة بنسبة 1٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة. بعد التثبيت ، اغسل الشريحة جيدا ب 1,000 ميكرولتر من PBS ثلاث إلى خمس مرات واترك طبقة من PBS على الأنسجة حتى خطوة التشعيع الضوئي. لتحضير صندوق التشعيع الضوئي ، اجمع مصباح LED بقوة 150 واط ، ومصباح LED للفيضانات RGBW بقوة 40 واط ، وحاوية بلاستيكية كبيرة بسعة 75.71 لترا أو أكثر ، و PBS طازجة ، وطبق بتري. الآن املأ طبق Petri ب 1x PBS لغمر الشريحة بالكامل. قم بإجراء التشعيع الضوئي في غرفة باردة لتقليل الحرارة من المصابيح. ثم ضع الشريحة في طبق بتري ، وتأكد من غمرها بالكامل في PBS. بعد ذلك ، ضع المصباح بقدرة 40 واط فوق طبق Petri مباشرة بحيث يكون مصدر الضوء متجها لأسفل باتجاه الشريحة واضبط المصباح على وضع الضوء الأحمر. أخيرا ، قم بتشغيل كل من المصابيح بقوة 150 واط و 40 واط وقم بتغطية الإعداد بالكامل بغطاء الحاوية البلاستيكية. بعد ساعتين ، قم بتبديل المصباح إلى الضوء الأخضر واحتضان لمدة 16 ساعة. تم تحديد ألمع الفلوروفورات المتوافقة مع بروتوكول تعطيل الصبغة وإقرانها بعلامات معبر عنها بشكل منخفض لتعزيز اكتشاف الإشارة. تم تقليل التألق الذاتي بشكل ملحوظ بعد التشعيع الضوئي ، وعند الأطوال الموجية للتصوير الأطول. الأجسام المضادة المترافقة مباشرة التي تستهدف العلامات الهيكلية المعبر عنها للغاية ، أكتين العضلات الملساء ألفا وعموم السيتوكيراتين ، تم استبدالها في قناة الأشعة تحت الحمراء القريبة عند 750 نانومتر. تم طرح إشارة الخلفية حسابيا باستخدام صورة مرجعية غير ملوثة وحساب SimpleITK ، وتم تحسين الإشارات الحقيقية من خلال العتبة. كشف تصوير الشرائح الكاملة للأقسام الملطخة بالIBEX عن أورام حبيبية ذات نوى نخرية وعدلات إيجابية CD15. تم الكشف عن المتفطرة السلية أو البكتيريا الفطرية غير السلية بالقرب من اللب النخر للورم الحبيبي باستخدام الجسم المضاد للمستضد 85B. احتوت الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالورم الحبيبي على خلايا بائية إيجابية CD20 ، وخلايا تائية موجبة CD4 ، وعدد قليل من الخلايا التائية الإيجابية CD8 ووضع العلامات CD45 لجميع الخلايا المناعية في الرئة. كما مكن تصوير IBEX من تصور السمات التشريحية للرئة ، بما في ذلك الخلايا الظهارية القصبية والعضلات الملساء الشريانية والضامة الإيجابية CD68.