تحسين توصيل الجينات والتعبير عنها باستخدام الحقن داخل العظام لجزيئات الشيتوزان النانوية المغلفة بلازميدات محرر قاعدة الأدينين

نقترح طريقة العلاج الجيني التي توصل مباشرة المحرر القائم على الأدينين الشيتوزان إلى نخاع العظم من خلال الحقن داخل العظام. كفاءة تعداء البلازميدات الخارجية إلى التجارب منخفضة نسبيا وقد يتأثر إدخال البلازميدات للتعبير الجيني على المدى الطويل بجهاز المناعة. نستخدم الشيتوزان لتغليف بلازميدات المحرر القائمة على الأدينين وتوصيل المركب مباشرة إلى نخاع عظم الفئران من خلال الحقن داخل العظم ، مما يجعله مناسبا للأمراض التي تسببها وظيفة ناقضات العظم غير الطبيعية.

يوفر بروتوكولنا كفاءة تعداء عالية ، وأضرار بيولوجية صغيرة ، وكفاءة عالية في التعبير الجيني. استراتيجيتنا الجديدة ليست مناسبة فقط للأمراض التي تسببها وظيفة ناقضات العظم غير الطبيعية ، ولكنها تتمتع أيضا بإمكانيات كبيرة للنهوض بمجال العلاج الجيني. للبدء ، ضع فأرة مرح على طاولة عمل.

باستخدام المقص الجراحي والملاقط ، قم بإزالة الظنبوب وإزالة جميع الأنسجة العضلية المحيطة. انقعي الساق النظيف في PBS واغسليه حتى يتبقى العظم فقط. ارسم مليلترا واحدا من PBS في حقنة واغسل خلايا نخاع العظم من أحد طرفي الظنبوب حتى يتحول لون العظم إلى اللون الأبيض تماما.

بعد ذلك ، اجمع تعليق الخلية في أنبوب. قم بالطرد المركزي عند 800 جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد إخراج المادة الطافية ، أضف 500 ميكرولتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء إلى الحبيبات.

بعد دقيقة ، أضف مليلتر واحد من المخزن المؤقت للفصل لإنهاء التحلل. جهاز الطرد المركزي التعليق مرة أخرى عند 800 جرام عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وضع حبيبات الخلية الناتجة على الثلج لاستخدامها لاحقا.

لتعداء الشيتوزان ، قم بإذابة أربعة ملليغرامات من الشيتوزان في 20 مل من محلول حمض الخليك. اضبط الرقم الهيدروجيني على 5.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 10 مولار. ثم قم بتوزيع 500 ميكرولتر من محلول الشيتوزان في أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية.

أضف الآن اثنين وثلاثة وأربعة وخمسة ميكروغرامات من بلازميدات ABE في أنابيب فردية. قم بإذابة البلازميدات في 500 ميكرولتر من 30 ملليمولار من كبريتات الصوديوم. ثم اخلطي 500 ميكرولتر من محلول البلازميد مع 500 ميكرولتر من محلول الشيتوزان في الأنابيب المقابلة.

احتضن الأنابيب في حمام مائي على حرارة 50 إلى 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بتدوير كل أنبوب لمدة 15 إلى 30 ثانية واتركه دون إزعاج لمدة 30 دقيقة. للتوصيف ، قم بتحليل قطر وإمكانات زيتا للشيتوزان باستخدام تشتت الضوء الديناميكي.

حافظ على تركيز الشيتوزان عند 0.1 ملليغرام لكل مليلتر في الماء المقطر المزدوج. بعد ذلك ، قم بإلقاء 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من عينات الشيتوزان على شريحة سيليكون. أضف 20 ميكرولتر من العينات المعلقة إلى 200 شبكة شبكية واحتضنها.

معلق خلايا نخاع العظم بالطرد المركزي عند 800 جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ، ثم أضف 500 ميكرولتر من محللة خلايا الدم الحمراء. بعد دقيقة ، أضف مليلترا واحدا من المخزن المؤقت للفصل لإيقاف التفاعل.

ثم احسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. بعد ذلك ، انقل مليون خلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد. بعد الطرد المركزي مرة أخرى ، قم بإخراج المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS.

انقل الخلايا المعلقة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي وقم بقياس كفاءة التعداء باستخدام قياس التدفق الخلوي. لحقن تجويف نخاع العظم ، قم بتثبيت الفأر المخدر في وضع ضعيف على طاولة العمليات. استخدم شريطا لاصقا لتثبيت الطرف الأمامي في مكانه.

تطهير الظنبوب الخلفي باستخدام مسحة كحولية. ثم قم بتحميل محلول البلازميد في حقنة سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 26. قم بإزالة أي فقاعات هواء واحتفظ بالمحقنة جاهزة للحقن.

بعد ذلك ، المس ساق الماوس وثبته بأصابعك. ضع إبرة الحقن لدخول عمود الظنبوب من هضبة الظنبوب بالقرب من مفصل الركبة. الآن قم بتدوير الإبرة بالتوازي مع الظنبوب ، وأدخلها في تجويف نخاع العظم وحقنها ببطء على مدى ثلاث ثوان.

بعد الحقن ، اسحب الإبرة ببطء على مدى ثلاث ثوان. قم بتطهير موقع البزل على الفور باستخدام مسحة كحولية لوقف أي نزيف. ضع الماوس في بيئة دافئة عند 37 درجة مئوية لتسهيل تعافيه.

الجسيمات النانوية المتكونة من بلازميدات ABE و GRNA لها مورفولوجيا كروية موحدة وتوزيع ضيق الحجم بمتوسط حجم 202.9 نانومتر. جهد زيتا 2.77 ملي فولت ومؤشر تشتت بولي 0.22. قام بلازميد ABE المضمن بالشيتوزان بتحسين إشارة الفلورسنت بشكل كبير في خلايا نخاع العظام مما يشير إلى كفاءة تعداء أعلى مقارنة بالمجموعة الضابطة.

أكد قياس التدفق الخلوي أن بلازميد ABE المشفر بالشيتوزان حقق كفاءة تعداء عالية في خلايا نخاع العظام. مع كفاءة قصوى تبلغ 51.2٪ لوحظت بجرعة أربعة ميكروغرام ، بينما وفرت ثلاثة ميكروغرامات توازنا من الكفاءة العالية بنسبة 47.2٪ تسلسل سانجر وتفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي الجيني لخلية نخاع العظم تم الكشف عنه في الجسم الحي في الموقع المستهدف A1 بكفاءة 14.27٪ وفي الموقع A2 بكفاءة 10.69٪.