سير العمل باستخدام مجهر مضان وإلكتروني وشعاع أيوني متزامن مبرد للطحن المستهدف للخلايا

تطور أبحاثي طرق المجهر الضوئي للحفاظ على الميزات الخلوية في الصفائح المبردة أثناء طحن شعاع الأيونيات المركز، مما يتيح تحليلا تفصيليا باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني المجمد للكشف عن التنظيم البيولوجي الطبيعي. تم دمج المجهر البصري في أنظمة CryoFIB-SEM، لكنه نادرا ما يكون في نفس موقع FIB. وهذا يتطلب نهج إرشادي قائم على التسجيل للحفاظ على الأهداف الموسومة بالفلورية في الصفائح النهائية.

للبدء، قم بتبريد محطة النقل يدويا باستخدام النيتروجين السائل بمجرد وصول المرحلة إلى درجات الحرارة التبريدية. قم بتحميل شبكة أوتوماغراد مقطوعة واحدة في شريط العينات المصمم لنظام المجهر الضوئي بالتبريد. تأكد من أن الشبكة الذاتية موضوعة بين غطاء الغطاء الملصق والفاصل.

شد برغي الحلقة لإغلاق الكاسيت وأدخله في الفتحة على محطة النقل. قم بتوصيل محطة النقل بنظام المجهر الضوئي بالتبريد. استخدم كاميرا الحجرة الداخلية لتوجيه شريط العينات إلى مرحلة العينة.

في برنامج المجهر الضوئي، تحرك مرحلة العينة من وضع التحميل إلى موضع الثلاثة حزم المحددة مسبقا. في برنامج FIB-SEM، اضبط التكبير على 100X وانقر على النافذة العلوية اليسرى. في تبويب المحاذاة في برنامج المجهر الضوئي، انقر على زر Z واختر وظيفة التشغيل للحصول على أطلس SEM للشبكة.

حدد منطقة مربعة بها فيلم كربوني مكسور وانقر عليها مرتين لنقل مرحلة العينة إلى ذلك الموقع. ارجع إلى واجهة البرمجيات. فعل FIB واحصل على صورة.

قم بضبط التكبير باستخدام القائمة المنسدلة في الزاوية العلوية اليسرى. اضغط على التشغيل لعرض صورة FIB. ثم اضبط حجم الخطوة باستخدام شريط الانزلاقات.

الآن اضغط على Z و Z لضبط موضع المرحلة Z حتى تتوافق الصورة الأفقية الموجودة في الأيون وصور الإلكترونات مع نفس الميزة. اختر تبويب SEM في برنامج المجهر الضوئي. استخدم أزرار X و Y لمحاذاة ميزة مشتركة بين صور SEM وصور الأيونات.

الآن شغل مجهر الفلورة. اختر تبويب FLM، وحدد شروط تصوير الضوء المنعكس، ثم اختر تشغيل. ثم قم بمحاذاة صورة الضوء المنعكس مع صورة SEM.

قم بتكبير الصورة وانقر على خيار المستطيل لتحديد نمط التفريز لشعاع الأيون. اضغط على بدء النمط في العرض 2 لتشكيل نمط صغير باستخدام شعاع الأيونات المركز. تأكد من أن النمط المطحون مرئي في كل من شعاع الأيونات المركز والمجهر الفلوري.

في برنامج المجهر الضوئي، انتقل إلى تبويب التحديد الموقع وفعل الظروف المناسبة لإعداد قنوات الفلورسنت. قم بتعيين كل فلوروفور لقناة منفصلة وإضافة قناة إضافية للمجال المضيء. قم بضبط قدرة LED ووقت التعريض لكل قناة فلورية لتحديد الهدف المطلوب.

بمجرد أن تصبح المعايير مرضية، يمكنك الحصول على مكدس Z فلوري قبل الطحن عن طريق المرور عبر الاتجاه المحوري. ثم حدد الهدف كمنطقة اهتمام. انتقل إلى برنامج FIB-SEM وارسم صفائح في المنطقة المعنية.

قم بعمل طحن خشن لإزالة المادة السائبة مع إبقاء المجهر الفلوري مفعلا لمراقبة تغيرات الإشارة. افتح مجموعة أدوات التداخل المبنية على بايثون من الطرف لمراقبة الإشارة الفلورية أثناء تخفيف الصفائح. قم بتخفيف العائد على الاستثمار إلى حوالي ميكرومترين باستخدام وضع المقطع العرضي للتنظيف.

بالنسبة لهدف بامتداد محوري يزيد عن 300 نانومتر، يتم اختيار الهدف في واجهة بايثون في المجهرية الفلورية. سيبدأ البرنامج تلقائيا في رسم السطوع كدالة زمنية مع كل إطار جديد. راقب شدة الفلورة من خلال مجموعة أدوات بايثون.

قم بطحن العينة باستخدام وضع المقطع العرضي لإزالة أي طبقة دعم متبقية من أسفل المنطقة المعنية. راقب الانخفاض المفاجئ في شدة الفلورة كمؤشرات لتغيير اتجاه التفريز. إذا لاحظ انخفاض حاد عند الطحن من الأسفل إلى الأعلى، توقف وابدأ في الطحن من الأعلى إلى الأسفل.

بعد الانتهاء من الطحن من الأعلى إلى الأسفل، قم بإنهاء الطبقة اللاميلا عن طريق الطحن من الأسفل للأعلى بوضع تنظيف المقطع العرضي حتى الوصول إلى السماكة المطلوبة. ثم التقط صورة فلورية بعد الطحن للصفائح. انقل العينة إلى جهاز CryoTEM.

قم بتحميل صورة الفلورة متعددة القنوات بعد الطحن وصورة إسقاط CryoTEM في برنامج التحويل الإسقاطي المخصص لتسجيل المناطق المعنية. الآن اختر ثمانية إلى عشرة أزواج من نقاط المرجع المرئية في صور الفلورة والمجهر الإلكتروني لحساب التحويل الإسقاطي. استخدم الصورة المثبتة كدليل لاختيار منطقة التصوير.

ثم اختر معايير التكبير والاكتساب المناسبة لسلسلة الميل حسب حجم هيكل الهدف والدقة المرغوبة. أظهرت الخلايا البلعمية المتمايزة الموسومة ب SiR-Tubulin نقطة ثقل فلورية ساطع واحدة، قطرها حوالي ميكرومتر واحد، تتوافق مع MTOC، إلى جانب هياكل شبيهة بالألياف تشع نحو محيط الخلية المتوافقة مع شبكة الأنابيب الدقيقة. عندما تم طحن العينة إلى حوالي 800 نانومتر في السماكة، تم تفكيك ثقب MTOC الفلوري الواحد إلى نقطتين مميزتين، كل منهما قطره حوالي 700 نانومتر.

زادت شدة الفلورة بعد إزالة المادة السائبة غير الفلورية وطبقة الدعم الماصة، تلتها انخفاض حاد مع تخفيف الصفيحة من ميكرومترين إلى أقل من 200 نانومتر. مكن التألق المجيري المجهر الإلكتروني المتواصل استهداف الهياكل بدقة أثناء الطحن. تكشف النماذج المصورة المعاد بناؤها والنماذج المجزأة أن الجولات المركزية تتكون من ثلاثيات الأنابيب الدقيقة.

في الحالات التي تم فيها الاحتفاظ بنقطة فلورية واحدة فقط في الصفيحة النهائية، تم رؤية مركز مركزي واحد في التصوير المقطعي المقابل. دقة التألق المعتمد على الميلينج محدودة بأساليب التسجيل، التي تعاني كثيرا من الدقة المحدودة للحيود وعدم تطابق معامل الانكسار، وكذلك الحركة الناتجة عن الطحن. يقوم المجهر البصري المتزامن والطحن بالألياف البصرية (FIB) بإزالة أخطاء التسجيل من خلال استخدام التغذية الراجعة الفورية من المجهر الفلوري لتوجيه عملية الطحن.

هذا يتجنب الأخطاء الناتجة عن حد الحيود وعدم تطابق معامل الانكسار، مما يتيح طحنا دقيقا يحافظ على الهياكل الموسومية الفلورية للتصوير المقطعي للإلكترون داخل الصفيحة النهائية. يتيح بحثنا رؤية البنى الخلوية التي كان من الصعب سابقا رؤيتها مباشرة بواسطة التجميد المغناطيسي، مما يسلط الضوء على الآليات الجزيئية وراء طيف واسع من الآلات الدقيقة الجزيئية الرئيسية.