نموذج الفأر لمرض الكبد الدهني المرتبط بخلل التمثيل الغذائي مع التليف

في أبحاثنا، نركز على مرض الكبد الدهني المرتبط بخلل الأيض، أو MASLD، وبشكل خاص على آليات تراكم الدهون والتليف. بعض التطورات الحديثة تشمل علم النسخ أحادي الخلية وعلم النسخ الخاص، وتوحيد نماذج ل MASLD، والموافقة على السيماجلوتايد لعلاج MASLD. هناك العديد من النماذج الحيوانية لمرض MASLD، لكننا اكتشفنا أن العديد منها لم يسبب تليف الكبد.

لذا، لمعالجة هذه النقطة، طورنا نموذج الفأرة ل MASLD. نموذج الفأر لدينا يحفز مرض MASLD مع التليف عن طريق إطعام الفئران المصابة بفرط التنهام نظاما غذائيا مشابها للنظام الغذائي الأمريكي العادي. وهذا يسبب اضطراب العضلة العضلية المفرطة للسرطان العضلي (MASLD) الذي يشبه كثيرا المرض في البشر.

ستسهل طريقتنا دراسات حول الفيزيولوجيا المرضية لاضطراب العضلة العضلية المفرطة المتوسطة واختبار العلاجات الجديدة. للبدء، احصل على قسم نسيج كبد مدمن بالبارافين على شريحة (slide). لإزالة البارافين، اغمر السلايد في الزيلين أو السيتريزولف لمدة خمس إلى خمس عشرة دقيقة.

ثم أعد ترطيب القسم بشكل تسلسلي ب 100 و95 و70٪ إيثانول، ثم الماء المقطر لمدة خمس دقائق في كل منها. ثم صبغ القسم ب Sirius Red وجفف الشريحة. أزل شريحة واحدة في كل مرة من محلول التنظيف وادهنها على منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد.

أضف حوالي 50 إلى 100 ميكرولتر من وسط التثبيت إلى القسم. غط الجزء بغطاء واضغط عليه بلطف لإزالة فقاعات الهواء. دع السلايد يجف بالهواء.

الآن، راقب القسم المعد تحت مجهر ضوئي مع إضاءة مجال ساطع باستخدام أهداف من 4x إلى 20x. انقل حوالي 500 إلى 1000 ميكرولتر من الكبد إلى أنابيب طرد مركزي بسعة 1.5 ميليتر، وأضف حمض ثلاثي كلورو أسيتيك للوصول إلى تركيز نهائي 12٪، ثم دوامة الأنبوب لفترة وجيزة لخلط المحتويات. حضن الأنبوب في حمام ماء مثلج لمدة 30 دقيقة، ثم قم بطرد مركزه على حرارة 6,000 جرام عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم أزل الفائق باستخدام ماصة. أضف ملليتر واحد من الإيثانول البارد 100٪ لغسل الحبيبة ثم صوتية لإعادة تعليقها جيدا. بعد إعادة توصيل نظام التعليق المركزي، استنشق السوبرناتانت.

بعد الغسل الثالث، أبق الأنبوب مفتوحا لتجفيف الحبيبة في الهواء لمدة 10 دقائق أو أكثر حسب الحاجة. ثم أضف 800 ميكرولتر من 6 حمض الهيدروكلوريك العادي إلى الأنبوب الذي يحتوي على حبيبة البروتين، وأعد تعليق الحبيبة باستخدام جهاز السونيكاتور كما أوضح سابقا. انقل التعليق إلى أنبوب زجاجي مغلق بمسامير أو قارورة وأغلق الغطاء بإحكام.

حضن الأنبوب في فرن عند درجة حرارة 110 درجة مئوية لمدة حوالي 22 ساعة. إذا لزم الأمر، انقل المحتويات من الزجاجة إلى أنبوب الطرد المركزي قبل الدوران. قم بطرد المركزي بالعينة المحللة على 16,000 جرام لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الفائقة التي تحتوي على الهيدروكسي برولين إلى أنبوب بسعة 1.5 ملليتر.

لأكسدة الهيدروكسي برولين، أضف 450 ميكرولتر من محلول الكلورامين إلى أنابيب تحتوي على 50 ميكرولتر من العينة والمعايير. اخلط محتويات الأنابيب مع دوامة، وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. ثم أضف 500 ميكرولتر من مادة إيرليش إلى كل عينة وكل معيار.

بعد الدوامة، حضن العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الحاضنة. بعد الحضانة، دع الأنابيب تبرد إلى درجة حرارة الغرفة وراقب اللون النهائي للعينات. وأخيرا، قياس امتصاص العينات والمعايير باستخدام مقياس طيف فوتومتر بطول موجي قدره 550 نانومتر.

أظهر تلوين الكولاجين لأنسجة الكبد ببيكرو سيريوس الأحمر، عند ملاحظته بإضاءة ساحل ساطع، اللون الأحمر الكولاجين مع خلفية برتقالية فاتحة أو صفراء. تم تلوينات ترسيب الكولاجين المرتبط بالتليف وكذلك الكولاجين في جدران الأوعية الدموية، والهيلوم، وكبسولة الكبد. كشف المجهر الضوئي المستقطب عن ألياف كولاجينية ثنائية الانكسار مميزة على خلفية داكنة، مما عزز تصور التليف.

أظهر قياس منطقة الكولاجين الإيجابية للكبد في فئران الأجوتي الصفراء التي تم تغذيتها بنظام غذائي عالي الدهون والفركتوز (HFFD) نسبة أعلى بشكل ملحوظ عن التليف مقارنة بالفئران البرية الضابطة التي تم تغذيتها بنظام غذائي منخفض الدهون والفركتوز. كشف قياس محتوى هيدروكسي برولين الكبدي عن مستوى أعلى بشكل ملحوظ في فئران الأجوتي الصفراء التي تم تناولها حمية HFFD مقارنة بالفئران الضابطة بعد 16 أسبوعا من النظام الغذائي، مما أكد زيادة ترسيب الكولاجين في الكبد الليفي.