اختبار الحواجز الفسيولوجية لانتقال الفيروس عن طريق Microinjection في المن

إذا كانت الحشرات ناقلات فعالة للفيروسات النباتية، وفي حال استخدام الحقن المجهري للفيروس، فإن الإجراء الذي سنعرضه لكم اليوم هو تقنية تتيح للباحثين حقن الفيروس مباشرة في الخلايا الدموية (hemocytes) لحشرة AFib، متجاوزين بذلك الأمعاء، التي تعد أحد الحاجزين الرئيسيين لانتقال الفيروس بطريقة دورية. مرحباً، أنا سيسيليا تامارين ديهي، باحثة ما بعد الدكتوراه في قسم أمراض النبات بجامعة كورنيل. سأوضح لكم اليوم كيفية حقن الفيروس في الخلايا الدموية لحشرة AFib، وهو الفيروس الذي يمكن نقله بعد ذلك إلى أنواع نباتية مختلفة.

على سبيل المثال، هذه النبتة مصابة بـ PLRV فيروس لفحة أوراق البطاطس. يمكنك ملاحظة الفرق بين النبتة السليمة والنبتة المصابة. وأبرز عرض هو التصلب الورقي.

يعتبر PLRV فيروساً من نوع luthier يتم نقله بواسطة APHIS في دم اللمف الخاص بها، وهو المعادل الحشري للدم في الثدييات. عندما يتغذى AFI غير مصاب على نبات مصاب، فإنه يلتقط الفيروس من خلال عصارة النبات، والتي يمكنك رؤيتها هنا. وبمجرد ابتلاعه، يجب أن ينتقل الفيروس من أمعاء الحشرة إلى دم اللمف، ومن ثم يجب أن يمر عبر الغدة اللعابية حتى يتم نقله مرة أخرى إلى نبات ESE.

وإذا كان من الممكن أن تكتسب الحشرة فيروسات عديدة أثناء التغذية على نبات ESE، فإن جزءاً أكبر منها فقط سيمر عبر الأمعاء والغدة اللعابية. وهما الحاجزان الرئيسيان للانتقال من أجل إصابة المزيد من النباتات تحت الاختبار. وإذا كانت حشرة المن غير قادرة على نقل الفيروس، فإننا نقوم بتغذيتها على أنسجة مصابة لمدة يومين، ثم نتركها تتغذى على نبات سليم لمدة خمسة أيام.

يتم بعد ذلك تبخير النبات، وبعد مرور ثلاثة أسابيع نبدأ في البحث عن الأعراض. وعندما نجد حشرة AFib غير قادرة على نقل الفيروس، يمكننا تقييم أي من الحاجزين يمنع الفيروس باستخدام إجراء الحقن المجهري، والذي سأعرضه لكم اليوم. في هذا الإجراء، يتم حقن الفيروس مباشرة في الخلية الدموية هناك، وبذلك يتم تجاوز حاجز انتقال الفيروس عبر الأمعاء.

دعونا نبدأ، وسأوضح لكم كيفية إجراء الحقن المجهري لبعض القمم النامية. هذه هي الإبر الزجاجية التي نستخدمها، حيث نقوم بسحب الإبر الزجاجية من هذه الأنابيب الزجاجية باستخدام جهاز سحب الشعيرات الزجاجية (APU).

هذا هو المحقن الدقيق، والمستخدم للحقن الدقيق للفيروس. سأبدأ الآن بوضع الإبرة في حامل الإبر.

سأقوم الآن بوضع الإبرة في مكانها. سأقوم الآن بتحميل الفيروس داخل الإبرة وصولاً إلى الجزء العلوي من هذه الخوذة. الآن نحتاج إلى وضع AFI من أجل الحقن المجهري.

سأقوم الآن بأخذ حشرة مَنّ مع الضغط المناسب وسأضعها في حامل مَنّ. من الناحية المثالية، سأحاول وضع ظهر المنّ مقابل الحامل لكي أتمكن من الوصول إلى الجزء البطني من المنّ. حسناً، ممتاز.

يمكننا الآن البدء بعملية الحقن المجهري. حسنًا، سأقوم الآن بتحديد موضع الإبرة وتقريبها من الـ AFib. والآن، سأجعل الإبرة تلامس الـ AFib، ولثقب الهيكل الخارجي، فإن أفضل طريقة هي محاولة الثقب بين القطع عند قاعدة الأرجل.

سأقوم الآن بالحقن. سأقوم بأخذ AFI بواسطة الفرشاة ووضعها في ورقة الاستعادة حيث سأتركها لتستقر لفترة وجيزة. نحتاج أيضاً إلى حقن AFI ضابط مجهرياً.

يتم إجراء حقن مجهري ضابط باستخدام المحلول المنظم فقط وبدون الفيروس. المحلول المنظم الذي نستخدمه هو phosphate buffer بتركيز 0.1 و pH سبعة. لذا، سأضع الـ A fit في نبات سليم حيث سأتركه ليتكيف لمدة خمسة أيام، بعد ذلك سأقوم بتغذية النبات والانتظار حتى تظهر الأعراض. بعد الحقن المجهري للـ NA من السلسلة السفلية، يتم قياس مستوى تعبير الجين المستهدف في الـ afi يومياً على مدار أسبوع.

لقد قمنا للتو بالحقن المجهري لـ afit لم يكن قادراً على نقل الفيروس. فإذا تمكن الـ AFI بعد الحقن المجهري من نقل الفيروس، فهذا يعني أن هذا الـ AFI يمتلك حاجزاً معوياً كان يمنع مرور الفيروس. أما إذا لم تظهر أي أعراض، فهذا يعني أن هذا الـ afit يمتلك حاجز غدد لعابية قوياً.

لقد عرضنا للتو كيفية حقن الفيروس مجهرياً في حشرات المن. يُستخدم هذا الإجراء ذاته لحقن الـ RNA مزدوج السلسلة مجهرياً في حشرات المن لإجراء تداخل RNA (RNAi)، وهي تقنية مثيرة للاهتمام تساعد في دراسة وظائف الجينات في المن. وبهذا نكون قد انتهينا من عملية الحقن المجهري.

أتمنى أن تنال إعجابكم وأن تكون مفيدة لتجاربكم. شكراً لكم.