سير عمل عملي لتحليل بيانات النسخ المكانية: من الحصول على البيانات إلى التحليلات المتقدمة

أهلاً بكم جميعاً. سنستعرض في هذا الفيديو مسار عمل تطبيقي لتحليل بيانات النسخ المكانية (spatial transcriptomics)، بدءاً من الحصول على البيانات وتحميلها، وصولاً إلى الاستكشاف الأساسي، وأخيراً التحليل المتقدم. وبشكل عام، يتكون سير العمل من ثلاث خطوات رئيسية.

أولاً، تحميل البيانات، وثانياً، الحصول على كود التحليل، وثالثاً، تشغيل مسار العمل (pipeline) لاستخراج النتائج. الخطوة الأولى، الحصول على البيانات وتجهيز هيكل المجلدات. أولاً، الحصول على مجموعات البيانات العامة للترانسكريبتوميك المكاني (spatial transcriptomic).

قم بتنزيل أرشيف البيانات الخام. ثم استخرج محتويات الأرشيف. ونظم الملفات وفقاً لبنية توجيهية موحدة.

أولاً، قم بإنشاء دليل بيانات رئيسي، ثم أنشئ دليلاً فرعياً مخصصاً لكل عينة. انقل الملفات الأساسية التالية لكل عينة إلى الدليل الفرعي المقابل. وبعد ذلك، أنشئ مجلداً فرعياً مكانياً (spatial sub-folder) داخل دليل كل عينة.

ضع الملفات التالية في المجلد الفرعي الخاص بالبيانات المكانية (spatial). ضع ملف مقاييس PC للميزات المفلترة S1 في الدليل الفرعي الرئيسي للعينة. قم بفك ضغط ملفات gzip الموجودة في المجلد المكاني.

تأكد من بقاء أسماء الملفات الأصلية تماماً كما تتطلب دالة load 10X spatial. الخطوة الثانية، إعداد بيئة البرمجيات. هنا نتجاوز عملية تثبيت لغة R ويبدأ عرض البيانات من مرحلة الحصول على نص التحليل البرمجي (script) من مستودع GitHub.

قم بتثبيت حزم R المطلوبة من Graham في ملف الموصل (conductor) عن طريق تنفيذ نص setup R البرمجي. قم بتثبيت auto suit من خلال تنفيذ أوامر التثبيت الواردة في ورقة المستند الرسمية. انتقل إلى رابط التثبيت الرسمي لاستعادة نصوص الإعداد البرمجية. قم بتهيئة بيئة Python المطلوبة وتبعيات النظام وفقاً لتعليمات صفحة الإعداد.

احصل على الأداة المخصصة من خلال الانتقال إلى مستودع GitHub وتنزيل الكود المصدري. انتقل إلى دليل TOS وقم بتثبيت تبعيات Python. الخطوة الثالثة، تحميل البيانات المكانية ومراقبة الجودة.

قُم بقراءة البيانات المكانية في كائن Seurat. استخدم read 10X image لتحميل صورة النسيج عالية الدقة يدويًا، مع تحديد مسار الصورة واسم الصورة.

استخدم الأمر load 10X spatial مع تعيين معيار الصورة (image parameter) على كائن الصورة الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة، ثم أنشئ كائن Seurat. احسب مقاييس ضبط الجودة. احسب النسبة المئوية للقراءات الميتوكوندرية باستخدام percentage feature set مع النمط mt.

قم بتصور البيانات وتفسيرها بناءً على مقاييس مراقبة الجودة (QC). أنشئ مخططات كمانيّة (violin plots) لكل من nCount_Spatial وnFeature_Spatial وpercent.mt باستخدام دالة violin plot.

أنشئ مخططات الميزات المكانية لهذه المقاييس باستخدام مخططات الميزات المكانية. وحدد البقع الموجودة خارج منطقة النسيج. اختياريًا، قم بتطبيق عوامل تصفية لإزالة البقع ذات الجودة المنخفضة.

بعد تشغيل السكربت، يمكنك الحصول على هذه النتائج، بما في ذلك مقاييس مراقبة الجودة (QC) والمخطط المكاني للميزات. الخطوة الرابعة: المعالجة المسبقة للبيانات، والدمج، والتجميع. قم بإجراء التسوية (Normalize) في مرحلة المعالجة المسبقة للعينات الفردية.

طبّق معالجة SC transform normalization على كل عينة بشكل منفصل باستخدام المقايسة Spatial. قم بدمج عدة عينات. جهّز قائمة كائنات SCTransform normalized لغرض الدمج.

تأكد من وجود تحليل RNA لكل كائن عن طريق نسخ التحليل المكاني. استخدم ميزات التكامل المختارة في تكامل PREP SCT لتحديد الميزات المتغيرة المشتركة. ابحث عن مراسي التكامل باستخدام find integration anchors مع تحديد طريقة التسوية SCT.

قم بدمج البيانات باستخدام IntegrateData. ثم أجرِ خفض الأبعاد في التجميع على المقايسة المدمجة. قم بتشغيل PCA على البيانات المدمجة باستخدام runPCA.

حدد العدد الأمثل للمكونات الرئيسية للتحليلات اللاحقة من خلال حساب التباين التراكمي المفسر. حدد نقطة المرفق (elbow point) برمجياً. قم بتشغيل UMap باستخدام عدد المكونات الرئيسية (PCs) الذي تم تحديده.

قم بتجميع الخلايا باستخدام FindNeighbors وFindClusters. حدد المكونات الرئيسية (PCs) المحددة في مجموعة دقة (resolution) 0.5. أجرِ تحليل التعبير التفاضلي بين المجموعات المستهدفة باستخدام دالة FindWorkers.

تحديد الجينات المتغيرة مكانياً. لكل عينة أصلية، قم بتشغيل أمر find spatially variable features باستخدام طريقة Moran's I على مقايسة SCT لحساب التصحيح الذاتي المكاني. بعد تشغيل هذا السكربت، يمكنك الحصول على مخطط المرفق (elbow plot)، ومخطط UMap، ومخطط العناقيد، والخريطة الحرارية لعلامات العناقيد، ومخطط البركان (volcano plot)، والجينات ذات التعبير التفاضلي للميزات المكانية، والجينات الموثوقة مكانياً، وعلامات طبقة القولون.

ومخطط النقاط الخاص بعلامات طبقة القولون، بالإضافة إلى العلامات في مخطط الميزات المكانية. الخطوة الخامسة، المعالجة الأولية لبيانات المرجع أحادية الخلية. قراءة مصفوفة تعداد تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) أحادي الخلية باستخدام read 10X، وإنشاء كائن Seurat.

قم بإجراء عملية معايرة مراقبة الجودة (QC normalization) وإزالة التكتلات (declustering) القياسية. احسب النسبة المئوية للقراءات الميتوكوندرية في الخلايا التي تمت تصفيتها. قم بمعايرة البيانات باستخدام تحويل SC transform.

قم بتعيين vara.to. كمتغيرات متغيرة، وقم بتصحيح نسبة percent.mt. ثم قم بإجراء تحليل PCA وUMap طويل المدى وتجميع الخلايا باستخدام طريقة اختيار PC الديناميكية الموضحة في الخطوات السابقة، وبعد ذلك قم بتوصيف أنواع الخلايا.

قم بحساب درجات الوحدات (module scores) للجينات الواسمة لأنواع الخلايا القياسية باستخدام AddModuleScore. ثم قم بتوصيف العناقيد بناءً على درجات الوحدات والمعلومات البيولوجية المعروفة. بدلاً من ذلك، يمكنك استيراد توصيفات محسوبة مسبقاً من البيانات الوصفية (metadata).

بعد تعلم هذا السكربت، يمكنك الحصول على مقاييس مراقبة الجودة (QC metrics). لقد قاموا بتحميل مخططات UMap حسب العنقود، وUMap حسب العينة، ودرجات نوع الخلية. الخطوة السادسة، فك الالتفاف الموجه بالمرجع باستخدام SPOTlight.

أولاً، قم بتجهيز البيانات لبرنامج SPOTlight. قم بتحويل كائن Seurat الخاص بالخلية الواحدة والموسوم وكائن Seurat المكاني إلى كائن تجربة الخلية الواحدة (single-cell experiment object). ثم قم بإجراء التسوية اللوغاريتمية لبيانات الخلية الواحدة باستخدام LogMoreCounts.

بعد ذلك، قم بتشغيل عملية فك الالتفاف (deconvolution) باستخدام SPOTlight. أولاً، حدد الجينات عالية التباين في بيانات الخلية الواحدة باستخدام ModelGeneVar. ثم احسب علامات أنواع الخلايا باستخدام score markers وقم بتصفيتها للحصول على علامات عالية الجودة.

قم بتقليل عينة المرجع أحادي الخلية لكل نوع من الخلايا إلى عدد يمكن التعامل معه لتقليل وقت الحوسبة. نفذ عملية فك الالتفاف (deconvolution) باستخدام دالة SPOTlight، مع توفير المرجع أحادي الخلية، والبيانات المكانية، وقائمة العلامات (marker list)، والجينات عالية التباين (HVGs)، ثم يمكننا تصور النتائج وتصديرها. يمكنك الحصول على نتيجة فك الالتفاف بهذا الشكل، حيث تظهر كمسار أنبوبي تشتتي (scatter pipe route).

الخطوة السابعة، فك الالتفاف غير الخاضع للإشراف باستخدام Stdeconvolve. أولاً، قم بتجهيز البيانات المكانية. استخرج مقاييس عدد الصفوف من كائن Seurat المكاني باستخدام GetAssayData مع فتحة counts.

قم بإزالة البقع والجينات منخفضة الجودة باستخدام التعدادات النظيفة من STdeconvolve. حدد أنواع الخلايا الكامنة للمرشحات التي عبرت عن أربعة جينات في حد أدنى من كسر البقع باستخدام restrict strict LDA عن طريق الوصول إلى نموذج التخصيص هذا عبر نطاق من أعداد المواضيع المحتملة باستخدام fitLDA. اختر النموذج الأمثل بناءً على الحد الأدنى من التعقيد باستخدام optimal model مع opt min.

قم بتحليل النتائج وتصويرها بيانياً. استخرج نسبة النمط المصلي، Theta، والملفات الجينية Beta للنموذج الأمثل باستخدام getBetaTheta. ولإضافة التفسير البيولوجي لمواضيع التآكل، قم باستيراد تعليقات منطقة الاهتمام التي تم إنشاؤها بواسطة أداة تحديد البقعة المكانية.

استخدم هذه التعليقات التوضيحية كمعلمة للمجموعة في دالة "مع جميع المواضيع" (with all topics). قم بإعادة إسقاط نسب أنواع الخلايا التي تم فك التلفيف (deconvolved) الخاصة بمشروعك على الإحداثيات المكانية ورمز نقاط العينات بالألوان حسب منطقة الاهتمام (ROI) الخاصة بها. بعد تشغيل السكريبت، ستحصل على نتيجة مشابهة لهذه، وهي عبارة عن حمولة أنبوبية للمقياس، مثل تلك التي ينتجها SPOTlight.

الخطوة الثامنة، دراسة التواصل المكاني بين الخلايا باستخدام Giotto. أولاً، قم بتحويل كائن Seurat إلى كائن Giotto. استخدم دالة createGiottoObject، مع توفير مقاييس العد المنخفض والإحداثيات المكانية.

قم بمعالجة كائن Giotto مسبقاً وأضف نتيجة فك الالتفاف (deconvolution). قم بتطبيع البيانات باستخدام normalized Giotto، وأضفها كتعليقات توضيحية للنمط المصلِي. اختر البيانات الوصفية للخلايا باستخدام addCellmetadata.

قم بإنشاء شبكة مكانية باستخدام createSpatialNetwork. قم بتحميل قاعدة بيانات للرابط والمستقبل في بيئتنا. قم بتشغيل explore CellCellcom لتحديد تفاعلات الرابط والمستقبل ذات الدلالة بين أنواع الخلايا الموجودة في تقارب مكاني.

يمكنك الحصول على المخطط النقطي للاتصال بين الخلايا على النحو الموضح هنا. الخطوة التاسعة اختيارية. تحديد البقع التفاعلي باستخدام SelectSpatialSpot.

قم بإعداد البيانات للأداة التفاعلية باستخدام السكربت six. استخرج الإحداثيات المكانية من كائن Seurat باستخدام GetTissueCoordinates. ثم قم بتنسيق البيانات وتصديرها.

قم بتصدير إطار البيانات التكويني إلى ملف CSV. ثم قم بإجراء تحليل منطقة الاهتمام. قم بتشغيل المخصص.

اختر تطبيقات البقع المكانية (spatial spots dash applications) وقم بتحميل ملف CSV. حدد البقع تفاعلياً بناءً على الموقع المكاني. ثم قم بتصدير قائمة البقع المختارة والمجموعة المخصصة لها، والمصنفة كملف CSV جديد.

نقوم فقط بالتحقق مما يمكن الحصول عليه بعد تشغيل السكريبت تِباعاً. يتم حفظ جميع النتائج في مجلد results five-fold. وكما ترون، يمكننا الحصول على مقاييس مراقبة الجودة (QC metrics) والقسمة.

ويمكنك التحقق من مخطط الميزات المكانية هنا. علاوة على ذلك، تم إجراء عملية فك الالتفاف بطريقتين: الموجهة وغير الموجهة. ونتائج SPOTlight موجودة هنا.

كما تلاحظون، تحتوي جميع البقع على معلومات النسب. كما تم هنا توليد نتائج فك الالتفاف غير الخاضعة للإشراف بواسطة STdeconvolve. وهذه هي نتيجة تجمعات Seurat للبقع في البيانات المكانية.

يمكنك أيضاً تصورها في مخطط الفريق المكاني (spatial team plot)، كما هو موضح هنا. وعلاوة على ذلك، يمكنك أيضاً الحصول على نتيجة التواصل بين البقع (spot-spot communication) باستخدام Giotto. إن سير العمل هذا بالكامل مفتوح المصدر بنسبة 100%.

تحليل تحديد البقع، بدءاً من مقاييس التعبير وصولاً إلى النمذجة المكانية المتقدمة. تُنفذ جميع الخطوات على جهاز بذاكرة وصول عشوائي (RAM) سعتها 16GB. وتتميز قاعدة الكود بأنها نمطية، حيث يوجد سكربت واحد لكل مهمة.

لاحظ أن مسار العمل هذا لا يغطي المعالجة الأولية بدءاً من ملفات FASTQ. ينصب التركيز على البيانات المكانية ثنائية الأبعاد (2D spatial data)، وتتضمن حالياً أدوات التنزيل الخاصة بـ Visium فقط. هذا كل شيء، شكراً للمتابعة.