بروتوكول جراحي لنافذة قمحية كبيرة وقابلة لإعادة الإغلاق تتيح تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربائية الطولية متعددة الوسائط لشبكة وضع الفأر الافتراضي

شبكة الوضع الافتراضي أو DMN هي شبكة حاسمة واسعة النطاق، تتعلق بمجموعة من الوظائف الإدراكية والاضطرابات النفسية العصبية مثل الاكتئاب. دراسة الديناميكيات المعقدة للDMN في نماذج الحيوانات توفر رؤى لا تقدر بثمن حول وظيفتها في الحالات الصحية والمرضية. ومع ذلك، كان التحدي الكبير هو إجراء تسجيلات كهربائية فيزيولوجية مستقرة وطويلة الأمد وواسعة النطاق من العقد العميقة والموزعة المتعددة، وهي DMN، في الفئران المستيقظة والسلوكية.

هنا، نقدم بروتوكولا جراحيا جديدا ذو مرحلتين تم تطويره في مختبر إيرو كاسترين. تخلق هذه التقنية نافذة جمجمة كبيرة ومتينة وقابلة لإعادة الإغلاق، تتيح تسجيلات طولية متكررة من أكثر من 1000 قناة قطب كهربائي في نفس الوقت. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج الميكرو-إلكتروكورتيكغرافيا على المستوى السطحي، وميكرو-ECoG، مع مسبارين من نيوروبكسل، مما يسمح بالوصول غير المسبوق إلى شبكة الوضع الافتراضي.

سيقدم هذا الفيديو دليلا خطوة بخطوة لهذا الإجراء الجراحي القوي من تحضير الحيوانات وزرع درع الرأس إلى إنشاء نافذة الجمجمة المزمنة، مما يضمن جمع بيانات عالي الجودة وطويل الأمد لأبحاث علوم الأعصاب الشبكية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المعروضة من قبل المجلس الوطني للتجارب في فنلندا وتتوافق مع التوجيه الأوروبي لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية. المرحلة الأولى، تحضير الحيوانات وزرع درع الرأس.

لإجراء هذه الإجراءات، ابدأ بتحضير جميع المواد والمعدات الجراحية اللازمة. قم بتخدير الفأر بنسبة 4٪ من الإيزوفلوران وحافظ على التخدير عند 1.5 إلى 2.5٪ مع معدل تدفق أكسجين 0.5 لتر في الدقيقة. احلق الفراء من أعلى الرأس وضع الحيوان على وسادة تسخين مضبوطة مزودة بحساس داخلي لدرجة الحرارة معاير لتثبيت درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية طوال العملية.

ضع مرهم الكربومر للعين لمنع جفاف القرنية. ثبت الفأر في الإطار المجسم بحيث تستلقي الجمجمة بشكل مسطح وأعطوا مسكنات الألم ومضادات الالتهاب قبل العملية عبر حقن تحت الجلد، مثل الكاربروفين، البوبرينورفين، والديكساميثازون. قم بتعقيم المنطقة المحلوقة بمحلول بوفيدون-يود وحقن محلول ليدوكائين-إبينفرين كمخدر موضعي تحت جلد فروة الرأس.

قم بعمل شق عرضي صغير عند خط الأذن وتوسيع الشق تدريجيا لكشف الجزء العلوي من سطح الجمجمة بالكامل. نظف الجمجمة المكشوفة بعناية باستخدام الأسيتون حتى تزال كل الغشاء الظاهرة لضمان التصاق قوي بالزرعة. استخدم شفرة مشرط دائرية غير حادة لإزالة أي بقايا من الشظايا المحيطة والأنسجة الضامة لم تحل بالكامل بغسول الأسيتون.

باستخدام جهاز المجسم، حدد منطقة مستطيلة بحجم 4 مليمتر × 7.6 ملم على الجمجمة بالنسبة للبريغما. يجب أن يمتد المستطيل بمقدار مليمترين جانبيا من البريغما على كلا الجانبين، وثلاثة مليمترات من الخلف، و4.6 ملم في الذيلي. بعد ذلك، حدد موقعي إدخال المجس داخل الجمجمة في نصف الكرة الأيمن.

حدد موقع المسبار الخلفي على بعد 1.66 ملم أمامي و1.95 ملم جانبيا من البريغما، وموقع المسبار الذيلي على بعد 2.2 ملم خلفيا و1.9 ملم جانبيا من البريغما. بعد ذلك، نقش نمط متقاطع فوق جميع أسطح العظام المكشوفة خارج منطقة النافذة المخصصة باستخدام شفرة جراحية رقم 11، وأنتج أخاديدا ضحلة لكنها محددة بعمق حوالي 0.2 إلى 0.4 مليمتر لتشكيل شبكة موحدة بمساحة مربعات تقارب واحد في ملم. أنشئ جهاز تطبيق غراء ناعم عن طريق تركيب إبرة معقمة بحجم 30 جالون على طرف قطعة القطن وثني الإبرة على شكل حرف V.

قم بتوزيع غراء السيانوأكريلات في قارب وزن بلاستيكي قابل للتخلص من مرة واحدة واغمس جهاز التطبيق في خزان الغراء. ضع غراء على كل سطح عظمي مكشوف ومنقوش، مع تطبيق لا أكثر من ترسيب واحد في كل موقع بحيث تكون التغطية شاملة، ولكن لا تكون مفرطة أبدا. اترك الغراء ليجف لمدة سبع دقائق قبل المتابعة.

لزرع التجويف المرجعي، اختر موقع الحفر فوق موضع المخيخ الأيسر لتجنب الأوعية السطحية المرئية. احفر ثقب التوجيه في دفعات مدتها خمس إلى عشر ثوان باستخدام شفرة فولاذية دائرية بسرعة 20,000 إلى 25,000 طلقة في الدقيقة حتى تصبح الثقب أكثر شفافية، كاشفة عن لون وردي فاتح. أدخل المقبس المرجعي المطلي بالذهب في فتحة التوجيه، وتثبيته بغراء السيانوأكريلات، وعزز الوصلة بأسمنت الأسنان القابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية.

قم بتجميد الأسمنت السني باستخدام ضوء LED لمعالجة القلم لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، ضع كمية صغيرة من الأسمنت السني القابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية على قمة عظم الظهيرة المكشوفة، وضع لوح الرأس تحت الجمجمة بحيث تستقر إحدى الحواف على سقالة الأسمنت السنية، الملتفة حول التجويف المرجعي، مع الحافة المقابلة على طبقة الأسمنت الجديدة. تأكد من أن لوحة الرأس في المنتصف ومستوية.

عزز الهيكل بتطبيق الأسمنت السني حول قاعدة لوحة الرأس وتدوير العظم المنقوش والتجويف المرجعي حتى يتم تشكيل حاوية مغلقة مستمرة حول محيط نافذة الجمجمة المستقبلية. وأخيرا، قمت بتجميد الأسمنت السني باستخدام ضوء LED لتثبيت القلم لمدة دقيقة واحدة. بمجرد أن يجف الأسمنت تماما، دع الفأر يستيقظ من التخدير.

المرحلة الأولى اكتملت الآن. دع الفأرة تستعيد العادة لمدة لا تقل عن 48 ساعة قبل الانتقال إلى المرحلة التالية. المرحلة الثانية، إنشاء نافذة الجمجمة المزمنة.

المرحلة الثانية تتطلب نفس الأدوات والأدوية الموجودة في المرحلة الأولى باستثناء التخدير الموضعي. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه المرحلة غشاء PDMS معقم ورقيق، سائل دماغي شوكي صناعي بارد محفوظا على الثلج، مادة سيليكون مطاطية للسليكون، وغطاء حماية مطبوع ثلاثي الأبعاد مخصص. بعد 48 ساعة على الأقل من الجراحة الأولى، أعد تخدير الفأر بالأيزوفلوران، وضعه على وسادة التدفئة في الإطار المجسم، وإعطاء الأدوية قبل العملية كما في المرحلة الأولى باستثناء مخدر الليدوكائين-إبينفرين الموضعي.

ابدأ بترقيق العظم باستخدام المثقاب السني على طول الخط المستطيل المحدد في المرحلة الأولى، بدءا من 25,000 طلقة في الدقيقة مع تثبيت جهاز الحفر بزاوية 90 درجة بالنسبة لسطح العظم، وقم بتمريرة أو مرتين أعمق قليلا على حواف المستطيل لإنشاء أخدود قطع أولي. احفر أخاديد ضحلة في العظم والأسمنت السني المجاور لنافذة الجمجمة عند إحداثيات إدخال المجس. تعمل هذه الأخاديد كمعالم بصرية دائمة تبقى مرئية بعد إزالة شريحة العظم وتستخدم لإعادة تموضع المجسات داخل الجمجمة بشكل متكرر في جلسات الفيزيولوجيا الكهربائية اللاحقة.

استخدم سائل دماغي شوكي صناعي بارد ومعقم بانتظام طوال فترة الحفر لمنع التلف الحراري للقشرة الدماغية الأساسية ولتقليل النزيف. قلل سرعة الحفر تدريجيا إلى 20,000 طلقة في الدقيقة مع ترقق العظم. استمر في الحفر على طول محيط المستطيل حتى يصبح العظم داخل الإطار خفيفا حوالي 90٪.

لا تحفر الجمجمة بالكامل في الجسم. انتقل إلى خطاف الدورا المنحني الدقيق. أدخل الطرف تحت حافة العظم الرقيق بحذر شديد، ثم مرر الخطاف على محيط النافذة، مع فصل شريحة العظم بعناية عن الجمجمة المحيطة والأنسجة تحتها.

ارفع شريحة العظم التي تم فصلها بنجاح بحذر باستخدام خطاف الجاف في الاتجاه الخلفي إلى الأمامي إلى حوالي 35 درجة فوق سطح الجمجمة. أمسك الحافة المرفوعة بالملاقط وتحرك بلطف يمينا ويسارا حتى ينفك الصفيحة تماما. نظف المنطقة المكشوفة من الدم المتجلط بلطف مع غسل متكرر من ACSF البارد جدا.

ضع غشاء PDMS معقم واحد مسبقا الصب مباشرة تحت سطح الجافية بعد أن يخف النزيف. عند قياسها بشكل صحيح، تغطي النافذة بدقة وتلتصق بشكل سلبي بالجافة، مما يثبتها مسطحة على الدماغ. أغلق فتحة الجمجمة بوضع مادة سدادة سيليكون.

املأ كل شق بين غلاف الأسمنت السني والحافة الداخلية للوحة الرأس، محاطا بالكامل ومتداخلا مع حواف غشاء BDMS. ثبت غطاء واقي مطبوع ثلاثي الأبعاد مخصص على لوحة الرأس بكمية صغيرة من غراء السيانو أكريلات لحماية النافذة بين جلسات التسجيل. الفأر الآن جاهز للتعافي ويجب نقله إلى قفصه المنزلي ليكون مأوى للحماية من تلف الزرعة.

تؤدي الجراحة الناجحة إلى نافذة شفافة وواضحة فوق القشرة الدماغية، مع وجود أوعية وعائية مرئية وعلامات قليلة على الالتهاب أو العدوى. يمكن الحفاظ على هذا الوضوح لأكثر من 21 يوما، مما يمكن من إجراء دراسات طولية طويلة الأمد. حافظت الإشارات الكهربائية الفيزيولوجية الخام المسجلة عبر النافذة المزمنة على جودة عالية عبر الخط الزمني الطولي.

هنا، تعرض آثار ميكرو-ECoG التمثيلية ذات النطاق العريض المأخوذة من شبكة خلفية رجعية وآثار جهد المجال المحلي داخل الجمجمة المتزامنة التي تم أخذها من قناة قشرية سطحية جنبا إلى جنب خلال أول يوم تسجيل و21 يوما بعده. تظهر تسجيلات اليوم الحادي والعشرين سعة إشارة مماثلة، ومحتوى طيفي، وغياب تشوهات الحركة والضوضاء مقارنة بتسجيلات اليوم صفر من نفس الحيوان، مما يؤكد أن الوجود المزمن لغشاء PDMS وختم السيليكون ولا الثقوب الجافية المتكررة أحدثا تدهورا ملحوظا في جودة الإشارة السطحية أو المجس داخل الجمجمة في الطبقات القشرية السطحية حيث من المتوقع أن يظهر التدهور أولا. التأكيد الأساسي لهذه التقنية هو جمع بيانات كهربائية فيزيولوجية متعددة الوسائط مستقرة وعالية الجودة مع مرور الوقت.

تسمح النافذة القابلة لإعادة الإغلاق بإدخال مجسات متكررة لتسجيل نفس مجموعات الخلايا العصبية على مدى أسابيع. عبر نطاق ألفا، تظهر مصفوفات قيمة قفل الطور المحسوبة من القنوات على طول مسبار القطب داخل الجمجمة عالي الكثافة في الذيل بنية وظيفية مستقرة بين خط الأساس وجلسة اليوم الحادي والعشرين بعد العلاج. يظهر هذا إعادة إدخال قابلة للتكرار في نفس الموقع القشري بدلا من تتبع رسمي لنفس الخلايا العصبية الفردية.

على الرغم من أن الترجمة التدخلية الطفيفة للذراع تمنع نفس الادعاء الوحدوي، إلا أن البنية السطحية والإقليمية الكلية لتفاعلات النطاق الألفا محفوظة، مما يدعم أن النافذة المزمنة تسمح بأخذ عينات طولية لنفس الدائرة الوظيفية. للتحقق المباشر من أن النافذة المزمنة تدعم الاستهداف الطبقي القابل للتكرار لنفس البنى العميقة عبر الجلسات، تم حساب خرائط كثافة المصدر الحالي أو CSD من قنوات LFP الخاصة بالمجسات. تظهر ملفات CSD المستثارة بالمحفزات أن توقيعات مصدر الحوض الطبقي المتوقعة، بما في ذلك القشرة قبل الحفلية ومنطقة الحزام الأمامية، محفوظة بين الجلسات.

تشابه تراكبات ملف القوة الطبقي بين الجلستين بشكل كبير عبر الجلسات، حيث أن ارتباط بيرسون هو 0.81. الفروق التي لوحظت في القشرة الحركية الثانوية على الأرجح ناتجة عن اختلافات الحركة بين التسجيلات. نظرا لأن رسم CSD يحمل معلومات تشريحية، يمكنه توفير قراءة غير نهائية خلال الجلسة عن المناطق الدماغية التي يأخذ فيها كل مسبار عينة حاليا بغض النظر عن تلوين الأنسجة بعد الوفاة.

يتم قياس قابلية تكرار وضع الميكرو-ECoG السطحية عبر الجلسات بشكل مستقل عن قراءة CSD داخل الجمجمة. يتم تراكب خرائط الطاقة المكانية محدودة النطاق من شبكة micro-ECoG في اليوم 0 واليوم 21، ويتم حساب الارتباط البكسلي للخريطتين بشكل منفصل للشبكتين الفرعيتين الرسترالية والذيلية. تظل ارتباطات الملف الفرعي مرتفعة، وكانت الرموز الشريطية المكانية للجلستين تشارك بشكل واضح نفس نقاط الطاقة القشرية على كل من النصفين الراستريال والذيلي.

لذا يدعم صف محاذاة جيبي مرئي عبر الشبكة الشفافة مع الأخاديد العظمية المنقوشة عند إحداثيات إدخال المجس إمكانية تكرار وضع الميكرو-ECoG على مستوى المليمتر خلال فترة طولية تبلغ 21 يوما. لتأكيد التقنية بشكل أكبر، تم إجراء تلوين كيميائي مناعي لاختبار GFAP و IBA1 في شرائح الدماغ بعد الوفاة بعد حوالي أربعة أسابيع من جراحة شق الجمجمة. يتم التعبير عن GFAP بواسطة الخلايا النجمية، التي ترفع تنظيمها في الدبقية التفاعلية مثل إصابات الدماغ أو الالتهاب.

أما IBA1 فيتم التعبير عنه بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة، وهي أكثر نشاطا خلال العمليات الالتهابية العصبية. تكونت مجموعة التحقق من الحيوانات التي أجريت فيها الجراحة الكاملة ذات المرحلتين، وأعيد فتح نافذة الجمجمة ثلاث مرات في اليوم التالي 0 و21 و22. ومع ذلك، لم يتم إجراء أي تركيب ميكرو-ECoG أو إدخال مجسات داخل الجمجمة في هذه المجموعة.

تم إعادة إغلاق النافذة بين الجلسات كما في التسجيل الكهربائي. لذلك، تعزل هذه المجموعة المساهمة الالتهابية للنافذة المزمنة والتعرض المتكرر للجافية من أي ضرر نسيج ناتج عن المجس. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في أي من المؤشرات بين مجموعة التحكم التي لم تخضع للجراحة ومجموعة المركبات التي خضعت للجراحة.

تظهر هذه الصور المجهرية الممثلة عدم وجود دليل نوعي على الدبقية التفاعلية أو تنشيط الدبقية الصغيرة في المنطقة الواقعة مباشرة تحت النافذة. ومع ذلك، لوحظ زيادة طفيفة في تنشيط الخلايا الدبقية وتنشيط الخلايا النجمية بجانب مسار المجس وفي نصف كرة إدخال المسبار على التوالي، وقد يكون ذلك على الأرجح نتيجة سرعة إدخال عالية جدا للمسبار داخل الجمجمة. الجراحة الناجحة تؤدي إلى نافذة شفافة وواضحة فوق القشرة مع تقليل الالتهاب.

بعد فترة العلاج المزمنة، قد يحدث بعض تورم الدماغ. يمكن إدارة ذلك من خلال المراقبة الدقيقة وإذا لزم الأمر، إعطاء مسكنات إضافية. للتسجيلات، ببساطة قم بإزالة الغطاء والمانع، ووضع شبكات micro-ECoG ومجسات Neuropixels، وابدأ جمع البيانات من الحيوان المستيقظ والسلوك.

باختصار، يوفر هذا البروتوكول الجراحي ذو المرحلتين طريقة موثوقة وفعالة للغاية لإنشاء نافذة جمجمة كبيرة ومزمنة في الفئران. المزايا الرئيسية للإجراء هي الضرر البسيط للجافية والتعرض الكبير الذي يوفره، وهو أمر حاسم لوضع شبكات ميكرو-ECoG السطحية وعدة مجسات عصبية عميقة في الدماغ في نفس الوقت. تتيح هذه الطريقة تحقيقا طوليا غير مسبوق للديناميكيات الفيزيولوجية الكهربائية على مستوى الشبكة في الدوائر الدقيقة الرقمية وغيرها من الدوائر واسعة النطاق.

يفتح الباب أمام تحقيقات أعمق في الأسس العصبية للسلوكيات المعقدة والفيزيولوجيا المرضية لاضطرابات الدماغ، مما يساعد في النهاية على تطوير علاجات جديدة.