تحديد الهيستونات المعدلة كركائز ارتباط لعضو عائلة سبيندلين البشري 4 (SPIN4) بواسطة مصفوفات الببتيدات وسحب النيوكليوسوم الأصلي

SPIN4 هو قارئ هيستوني منظم لتطور العظام. تسبب طفرات SPIN4 النمو الزائد، لكن دورها الممرض لا يزال غير واضح. يمكن تكييف هذا البروتوكول وتطبيقه لدراسة ركائز الارتباط بالبروتينات المرتبطة بالهيستون عبر جميع المساحات.

للبدء، جهز المحلول الحاجز بوزن خمسة جرامات من ألبومين مصل البقر (BSA)، وذوبه إلى 100 ملليلتر من محلول تخزين بروتين BC-150. بعد ذلك، استخدم قلما كاره للماء لتحديد منطقة التفاعل على مصفوفة الببتيدات للحفاظ على الكواشف. ثم ضع أوراق الترشيح في طبق بتيري بقطر 15 سنتيمتر ورطبها بالماء.

ضع المصفوفات على أوراق مرشحة مبللة وأضف 300 ميكرولتر من حاجز العزل بحذر لكل منطقة مصفوفة بعناية. غط واحتضن طبق بتري في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات. جهز ميكرومولار واحدا من بروتين SPINDLIN-4 المؤتلف FLAG الموسوم ب Spindlin-4، وببتيد 1X FLAG، كل منهما في مخزن حاجز.

انقل الكواشف وطبق المصفوفة إلى غرفة باردة لتقليل الخلفية وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. أزل حاجز العزل الزائد من المصفوفات. أضف بروتين FLAG SPIN4، أو التحكم الببتيد FLAG، إلى كل كتلة.

غط طبق البتري للحضانة طوال الليل في الغرفة الباردة. أضف 50 ملليلتر من محلول الغسيل من مصفوفة الببتيد إلى صندوق الغسيل. تخلص من محلول البروتين من المصفوفات وانقله إلى مخزن الغسيل مع جانب التفاعل للأعلى.

اغسل المصفوفات خمس مرات. قم بأول غسلتين لمدة دقيقة لكل منهما، تليها ثلاث غسلات متتالية مدة كل منها خمس دقائق. ثم اشطف بمحلول حاجز لإزالة المغسلات المتبقية.

أعد المصفوفات إلى طبق بيتري. أضف 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة FLAG إلى كل كتلة وحضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من محلول الأجسام المضادة، وانقل المصفوفات إلى مخزن الغسيل، وكرر عمليات الغسيل كما تم شرحها سابقا.

أضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية IgG المضاد للفأر الماعز المتقارن ب HRP إلى كل كتلة وحضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من محلول الأجسام المضادة واغسل المصفوفة خمس مرات كما هو موضح سابقا. ضع المصفوفات داخل واقي صفائح شفاف وأضف ملليتر واحد من الإضاءة الكيميائية المعززة، أو ركيزة ECL، لضمان تغطية متساوية.

أزل فقاعات الهواء المحبوسة. التقاط الإضاءة الكيميائية في الصور ذات المجال الساطع باستخدام جهاز تصوير رقمي. بعد رفع ملف البيانات الخام إلى برنامج تحليل مصفوفة الببتيدات الهيستونية المود، في تبويب محاذاة البقعة، تأكد من أن كل شبكة مركزة حول نقطة الببتيد الخاصة بها.

في الإحصائيات النقطية، تحقق من الارتباط النقطي المكرر وتأكد من أن الخطأ أقل من 5٪. استخدم تبويب التفاعلية لتقييم الارتباط عبر مختلف تعديلات الهستون. ثم استخدم تبويب الخصوصية لتحديد تفضيل ارتباط الببتيد المستهدف بين تعديلات الهيستون المختلفة. لتحضير مخزن حجب خرزتين مرتين (BE) للحجب من الخرز، أضف جراما واحدا من BSA إلى 10 ملليلتر من مخزن تحليل BC-150 ودوامة للذوبان.

نقل خرزات FLAG SPIN4 من النوع البري وخرز FLAG SPIN4 D82H الطفرة التي تحتوي على تركيزات متساوية في أنابيب منفصلة بسعة 1.5 ملليتر. أضف إلى العينة البرية حجم متساو من خرزات تحكم سلبية بتيد 1X FLAG بحجم 100 مليمولر. ضبط جميع العينات إلى أحجام منتظمة باستخدام كمية مناسبة من مخزن التحلل BC-150.

أضف حجم متساوي من مخزن حجب الخرز 2X لكل أنبوب لتكوين الحجم النهائي إلى ملليلتر واحد. حضن الأنابيب طوال الليل على مدور أنابيب مضبوط على أربع درجات مئوية و20 دورة في الدقيقة. لبدء ارتباط النيوكليوسومات، قم بإذابة 1X من مونونيوكليوسومات المستخرجة من HEK293FT الخلايا على الجليد.

للتحسين الأولي، احسب نسبة مولية واحدة إلى واحدة من 1X نيوكليوسوم إلى بروتين SPIN4. اخلط 1X نيوكليوسوم مع حجم متساوي من مخزن حجب الخرزات 2X. ثم ادمج الخليط مع خرزات مسبقة مسبقا في أنبوب بسعة 15 ملليتر وحضن الخليط لمدة أربع ساعات على دوار الأنبوب عند أربع درجات مئوية و20 دورة في الدقيقة للتعقيد.

قم بعمل طرد مركزي على حرارة 3000 جرام لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من السوبرناتانت، أعد تعليق الخرزات في ملليلتر واحد من محلول التحلل BC-150 وانقل إلى أنابيب بسعة 1.5 مليليتر. لغسل الخرزات ثلاث مرات، استخدم الطرد المركزي عند 3000 جرام لمدة دقيقة واحدة.

بعد التخلص من السوبرناتانت، أعد تعليق الحبيبة في ملليلتر واحد من محلول التحلل BC-150. حرك الأنبوب أحيانا لتوزيع الخرز بشكل موحد بين الغسلات المتكررة. ثم قم بغسلتين إضافيتين، تتضمن خطوة حضانة مدتها 10 دقائق على مدور عند 20 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية بين خطوات إعادة التعليق والطرد المركزي.

بعد الغسل النهائي، أعد تعليق الخرزات في تسعة أعمدة من مخزن التحلل BC-150. اخلط 160 ميكرولتر من الخرزات من كل عينة مع 40 ميكرولتر من مخزن Laemmli 5X Laemmli. سخن على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإزالة الطابع.

اختياريا، للحصول على نتائج أنظف مع خلفية أقل، يتم تنفيذ وهم ببتيد FLAG لمجمع النيوكليوسوم البروتيني. الطرد المركزي على 3000 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتليين الفضة والتلوين الغربي للتحقق من واكتشاف ارتباط SPIN4 المعدل ب Histone SPIN4.

يرتبط SPIN4 بشكل كبير بببتيدات هيستون H3 ليسين 4، أو H3K4، وأحادي الميثيل وثنائي الميثيل وثلاثي الميثيل. وعلى العكس، أظهر طفرة فقدان الوظيفة في SPIN4 D82H ارتباطا أقل بجميع الأهداف، مما يؤكد أن مجال تيودور 1 ضروري لارتباط الركيزة. تتأثر تقارب SPIN4 سلبا بتعديلات ما بعد الترجمة التي تصر على تأكيداتها، مثل H3R2me2s و H3R2me2a.

ملاحظات متسقة لمصفوفات الببتيدات، أظهر SPIN4 D82H انخفاضا عاما في ارتباط النيوكليوسومات مقارنة بنوع SPIN4 البري. أظهر تحليل البلوت الغربي الذي قارن عينات السحب من SPIN4 وSPIN4 D82H أيضا عدم ارتباط قابل للقياس بين SPIN4 D82H بببتيدات أحادية الميثيل أو ثنائي ميثيل أو ثلاثي ميثيل H3K4، مما أكد صحة هذه الأساليب المزدوجة لتحديد ركائز تعديل الهيستون النسبية بعد الترجمة بسرعة. التحقق السريع والمستهدف لركائز الارتباط في بروتينات الارتباط بالهيستون.

قد تختلف الشروط المطلوبة للتعبير والتنقية عن بروتينات ارتباط الهيستون لكل مرشح. مطياف كتلة هيستون بعد سحب المونونيوكليوسوم الأصلي سيعطي النطاق الكامل لPTMs الهستوني.