سبر للنشاط مجمع الميتوكوندريا في خلايا المنشأ الجنينية البشرية

تلعب الميتوكوندريا أدواراً عديدة في فيزيولوجيا الخلية، بدءاً من التمثيل الغذائي وإنتاج الطاقة وصولاً إلى برمجة موت الخلية وتخليق الهرمونات الستيرويدية. وعلى الرغم من أهمية الميتوكوندريا في كل من الوظائف الخلوية الأساسية والأمراض، فإن هناك القليل جداً المعروف عن وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وسلالاتها المتمايزة. في هذا الفيديو، سنوضح لكم كيفية تحليل معقدات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا في الخلايا الجذعية البشرية باستخدام مقايسات نشاط Ingel.

مرحباً، أنا إيفان أو في (Ivan OV) من مختبر مايكل تيتل (Michael Tetel) في قسم علم الأمراض والطب المختبري بجامعة كاليفورنيا لوس أنجلوس. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتقييم وظيفة معقدات التنفس الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. يتضمن تقييم النشاط داخل الهلام هذا عزل صفائح ميتوكوندريا خام من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، وفصل معقدات الميتوكوندريا الخاصة بنظام الفسفرة التأكسدية باستخدام الفصل الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد الطبيعي الشفاف عالي الدقة، يليه مقايسة النشاط داخل الهلام.

فلنبدأ الآن. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في عزل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. لهذا المقايسة، سنستخدم خلايا جذعية جنينية بشرية تم إنماؤها على طبق مغطى بمادة matrigel في ظروف خالية من الخلايا المغذية.

من أجل جمع الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية البشرية amry، نبدأ بغسلها باستخدام محلول one XPDS الدافئ بـ pH 7.4، ثم نعالج الخلايا بالتربسين لمدة خمس دقائق. يمكن استخدام 1 mL من تربسين 1x لكل بئر في طبق ذي ستة آبار. وبعد مرور خمس دقائق، يمكن إيقاف التفاعل بإضافة حجم مساوٍ من مثبط التربسين الطازج بتركيز 1 mg/mL في محلول one XPBS، ثم حصاد الخلايا.

يتم بعد ذلك طرد الخلايا التي تم جمعها مركزياً عند 200 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد عملية الطرد المركزي، يتم التخلص من السائل الطافي وإعادة تعليق الخلايا المترسبة في 0.8 إلى 1.7 milliliters من منظم عزل الميتوكوندريا البارد جداً مع مزيج طازز من مثبط البروتياز بتركيز 1x. تعتمد كمية المنظم المستخدمة على حجم الراسب الخلوي الناتج. وبعد إعادة تعليق الراسب، يتم تحضينه على الثلج لمدة 10 دقائق تقريباً.

بعد عملية التحضين، نقوم بتفتيت الخلايا باستخدام جهاز متجانس، وقد يتطلب ذلك حوالي 40 إلى 50 ضربة. يمكننا التحقق من اكتمال عملية التجانس عن طريق صبغ جزء من خلايا DOD بصبغة تريبان الزرقاء (trypan blue) وفحصها تحت المجهر الضوئي. يجب أن تبدو النتيجة كما هو موضح هنا.

هذه هي اللقطة الأولى بعد 50 ضربة باستخدام الهاون. وهذه هي اللقطة الثانية بعد 80 ضربة باستخدام الهاون. وبمجرد تجانس الخلايا، يتم طردها مركزياً عند 20,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. سيؤدي ذلك إلى الحصول على راسب ميتوكوندري خام، والذي سيحتوي أيضاً على النوى وشظايا خلوية أكبر.

قبل جمع الراسب، يجب وزن أنبوب الجمع لتقدير وزن الراسب اللاحق، ثم سكب السائل الطافي والتخلص منه، وبعد ذلك وزن راسب الميتوكوندريا الخام المترسب. ومن خلال طرح وزن الأنبوب في هذه المرحلة، يمكن البدء في إذابة الراسب، وهو ما سيتم توضيحه في الخطوة التالية. ومن أجل إذابة راسب الميتوكوندريا الخام، نبدأ بالحفاظ على الراسب فوق الثلج والخلط بواسطة جهاز الفورتيكس مع 35 µL من محلول الإذابة المبرد بالثلج.

لكل 20 مليجرام من الراسب، تم ذكر معلومات تفصيلية عن مركبات المنظم في البروتوكول المكتوب المرفق. بعد عملية الرج بالدوامة وإضافة منظم الإذابة وقبل إضافة digitonin، ننقل الراسب المعاد تعليقه إلى أنبوب مناسب للطرد المركزي عالي السرعة، ثم نضيف 20 ميكرولتر من digitonin بتركيز 10% وزن/حجم لكل 20 مليجرام من وزن الراسب، ونمزج عن طريق نقر الأنبوب، وبعد المزج جيداً، يتم تحضين الراسب الميتوكوندري لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق على الثلج. يمكن استبدال digitonin بـ DDM أو Triton X 100 لإذابة البروتينات.

قد يؤثر اختيار المنظف وكميته على تكوين المجمعات الفائقة أو الأشكال متعددة القسيمات للمجمعات الميتوكوندرية بعد الحضانة على الثلج. وبمجرد إذابة الراسب، سنقوم بطرده مركزياً عند 100,000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم سنجمع الراشح الرائق. نحن الآن مستعدون لتجهيز الراشح للتشغيل على هلام التدرج لإجراء الفصل الكهربائي للهلام التدرجي الطبيعي للميتوكوندريا.

نوصي باستخدام هلام أكريلاميد متدرج من 5% إلى 13% مع هلام تكديس بنسبة 3.5%. ولتحضير الهلام، سنستخدم خليط أكريلاميد بيس أكريلاميد كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. يتم تحضير محلول أكريلاميد بيس أكريلاميد مسبقاً ويُحفظ عند درجة حرارة 4°C في مكان مظلم.

تعتبر مادة الأكريلاميد وبيس-أكريلاميد مواد كيميائية سامة في كل من شكلها المسحوق والسائل، لذا يجب توخي الحذر الشديد عند التعامل معهما. نقوم بدمج محلول الأكريلاميد وبيس-أكريلاميد مع جزء من محلول منظم للهلام بتركيز ثلاث أضعاف (three x gel buffer)، والذي يتكون من 1.5 molar من حمض 6-أمينو هكسانويك، و 75 millimolar من APS عند pH 7.0. وتعتمد كمية محلول الأكريلاميد وبيس-أكريلاميد التي نضيفها إلى المحلول المنظم على النسبة المئوية للهلام التي يتم تحضيرها لإنشاء الهلام المتدرج.

سنقوم بتحضير مزيج بتركيز 4% ومزيج آخر بتركيز 13%، بينما سيكون تركيز هلام التجميع (stacking gel) هو 3.5%. لا تنسَ إضافة الجلسرول إلى المزيج بتركيز 13%. وعندما تصبح جميع المزيجات الثلاثة جاهزة، نضيف كمية مناسبة من كبريتات الأمونيوم (ammonium per sulfate) والـ temid إلى المزيجات، ثم نصب المزيجات في غرفة صب لتشكيل التدرج (gradient former casting chamber).

يحتوي الجزء الأيسر من الغرفة على الخليط بتركيز 5%. ويحتوي الجزء الأيمن من الغرفة على الخليط بتركيز 13% مع وجود قضيب تقليب مغناطيسي صغير. نبدأ بصب الهلام عن طريق فتح الجزء الأيمن من الغرفة.

بعد ذلك، نقوم فوراً بفتح الجزء الأيسر من الغرفة ونسمح للمحلول بتركيز 5% بالاختلاط مع المحلول بتركيز 13% لتكوين التدرج. ثم نضيف كمية صغيرة من الإيزوبروبانول إلى الجزء العلوي من الهلام لتشكيل حد مستقيم وحاد للهلام بعد عملية البلمرة. وبعد مرور ساعة تقريباً، وعند اكتمال بلمرة هلام التدرج، نقوم بإزالة الإيزوبروبانول وصب هلام التجميع بتركيز 3.5% في الجهاز ثم نضع مشط الهلام.

سنقوم بتجميع وتشغيل الهلامات في غرفة باردة تبلغ درجة حرارتها حوالي أربع إلى سبع درجات Celsius. لتشغيل هذا الهلام، سنستخدم محلولي منظمين مختلفين؛ ففي حجرة المصعد، سنستخدم محلولاً منظماً يحتوي على 25 millimolar من حمض الهيدروكلوريك بـ pH 7.0.

سيحتوي محلول منظم الكاثود على 50 millimolar من TRIC، و 7.5 millimolar من حمض الهيدروكلوريك، و 0.02% weight per volume من n-dodecyl-β-D-maltoside أو DDM، و 0.05% weight to volume من deoxycoate بـ pH 7.0. ومن أجل تحضير السائل الطافي ليتم تشغيله في الهلام الذي صببناه للتو، يُضاف محلول تحميل ليعطي تركيزاً نهائياً قدره 5% weight to volume من الجلسرول و 0.01% weight to volume من Ponto S؛ وعادةً ما نضيف محلولاً مركزاً بتركيز 10x يحتوي على الجلسرول وponcho s مباشرة إلى السوائل الطافية.

لقد أصبحنا الآن مستعدين لتحميل عينة الهلام على الهلام. سنقوم بتعبئة آبار الهلام بحجم يحتوي على 20 إلى 40 مليجرام من بروتين الميتوكوندريا الخام لكل مسار. ومباشرة بعد التحميل، يتم تشغيل الهلام عند 100 فولت.

بمجرد دخول العينة إلى هلام التكديس، يمكن رفع الجهد إلى 500 فولت مع تحديد التيار عند 15 ملي أمبير. وعلى الرغم من أننا نقوم عادةً بتشغيل الهلام طوال الليل بجهد يتراوح بين 70 و100 فولت، إلا أننا نوقف عملية الفصل الكهربائي عندما يقترب خط حاد من صبغة zos الحمراء من جبهة الهلام. والآن بعد انتهاء تشغيل الهلام، يمكننا تحليل نشاط مجمعات البروتين المختلفة مباشرة داخل الهلام.

تعتمد مدة التحضين لكل مقايسة على كفاءة إذابة البروتين وكمية المواد المضافة لكل بئر. وعادةً ما تعطي المعقدات واحد وأربعة وخمسة إشارات أقوى من المعقدين اثنين وثلاثة؛ لذا يجب أن تكون مدة التلوين للمعقدين اثنين وثلاثة أطول.

لاختبار نشاط المعقد، سنحتاج إلى استخدام محاليل منظمة محددة لكل معقد. يمكنك العثور على مكونات المحاليل المنظمة الفردية في البروتوكول المكتوب. سنقوم الآن بقص مسارات فردية من الهلام لإجراء فحوصات النشاط داخل الهلام (Ingel activity assays) بشكل منفصل.

بالنسبة لجميع المعقدات، يتم تحضين شريحة الهلام في المحاليل المنظمة الخاصة بها لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة لجميع المعقدات باستثناء المعقد الخامس. بعد التحضين، يتم تثبيت الهلام في 50%methanol و 10%acetic acid لمدة تتراوح من 15 إلى 45 دقيقة. يُحفظ الهلام المثبت في 10%acetic acid.

ترى هنا كيف يظهر صبغ المعقد واحد. توجد حزمة أرجوانية داكنة واحدة في شريحة الهلام تقابل المعقد واحد. تتيح لك أغشية الهلام الشفافة إجراء قياس الكثافة الضوئية لأنشطة المعقدات الميتوكوندرية وإجراء تحليلات مقارنة.

بعد عملية قياس التدفق الخلوي الكثيف، نقوم عادةً بتجفيف شرائح الهلام للتخزين طويل الأمد أو للمسح الضوئي من أجل الحصول على مجمع صور عالي الجودة؛ حيث يظهر المجمع الثاني بنفس اللون الأرجواني للمجمع الثالث والمجمع الرابع، وكلاهما يعطي حزمة صبغية برتقالية أو مائلة للاصفرار. وفيما يلي أمثلة على أنشطة الصبغ للمجمعات الثاني والثالث والرابع.

لقد استعرضنا للتو كيفية تحليل نشاط معقدات الأكسدة المفرزة من الميتوكوندريا، والتي تم استخلاصها من خلايا جذعية جنينية بشرية وفصلها باستخدام تقنيات عالية الدقة، بما في ذلك الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي. هذا كل شيء، شكرًا لمتابعتكم وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.