العدلة عزل بروتوكول

بروتوكول عزل الخلايا المتعادلة. ستقوم هذه العملية باستخلاص خلايا الدم البيضاء من عينة دم كاملة باستخدام جهاز طرد مركزي وأنابيب اختبار. وجهاز مزج دوامي وإبرة ومحقنة ومرشح محقنة.

مواد Millipore من العلامة التجارية MX gv بقطر مسامي 0.22 ميكرومتر. يتطلب فصل الخلايا المتعادلة باستخدام محلول هانك المتوازن الملحين نوعين من محاليل HBSS. سيتم استخدام HBSS المحتوي على كلوريد الكالسيوم لتحضير محلول مع ألبومين المصل البشري.

سيتم استخدام محلول HBSS الخالي من كلوريد الكالسيوم لتعليق وغسل الخلايا المتعادلة. يرجى توخي الحذر الشديد لاستخدام محلول HBSS المناسب في هذا الإجراء. أما ألبومين المصل البشري أو HSA فهو بروتين في بلازما الدم يحافظ على pH والضغط الاسموزي (SMO pressure).

لا تستخدم محلول تحلل كريات الدم الحمراء المكون من مزيج مصل بقري. يتم تصنيع هذا المحلول بواسطة Roche Diagnostics، ووسائط عزل الخلايا المتعادلة NIM من Cedar Line Labs ووسائط الفصل اللمفاوي Lymph light؛ يجب حماية وسائط الفصل من الضوء وحفظها في الثلاجة لتحقيق أفضل النتائج. يجب أن تكون جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة عند الاستخدام.

أخرج الكواشف من الثلاجة قبل ساعة واحدة من بدء التجربة. قم بتحضير محلول H-B-S-S-H-S-A لفصل الخلايا المتعادلة. انقل محلول HBSS المحتوي على كلوريد الكالسيوم باستخدام الماصة إلى القارورة.

اسحب HSA إلى المحقنة. تجنب حبس فقاعات الهواء. قم بإزالة إبرة المحقنة واستبدلها بالمرشح.

احقن HSA عبر مرشح في قارورة HBSS ثم استخدم جهاز vortex مرتين للخلط. عندما تكون المواد الأخرى جاهزة وفي درجة حرارة الغرفة، اسحب حوالي 15 milliliters من الدم الكامل. سينتج عن ذلك 10 إلى 15 milliliters تحتوي على 10⁸ من الخلايا المتعادلة (neutrophils). يجب ألا يكون المتبرع قد تناول الكحول أو الأدوية التي تصرف بدون وصفة طبية لمدة 24 ساعة قبل التبرع بعينة الدم.

يمكن لهذه العوامل أن تعيق عملية الفصل. يمكن منع تخثر الدم الكامل باستخدام EDTA citrate أو heparin عن طريق إضافة تسعة أجزاء من الدم إلى جزء واحد من K three EDTA sodium citrate، أو heparin وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. سيتم وصف الخطوات التالية في هذا الإجراء.

قم بفصل وإزالة البلازما والخلايا الوحيدة. افصل واحصل على طبقة الخلايا المتعادلة مع تحلل كريات الدم الحمراء لتعليق الخلايا المتعادلة الخالية في الفصل الأول. احصل على الخلايا المتعادلة في طبقة NIM.

اجمع 5 mL من وسط العزل في أنبوب طرد مركزي. يسمح وضع وسط العزل في الجزء السفلي من الأنبوب بأن يعمل كمرشح، حيث سيقوم جهاز الطرد المركزي بدفع الدم للأسفل من خلاله بعناية. أضف 5 mL من الدم فوق NIM لضمان فصل نظيف.

كن حريصاً جداً على تجنب خلط المحاليل. نفذ هذه الخطوة ببطء وعناية، مع إبقاء طرف الماصة قريباً من سطح وسط الفصل لمنع الاختلاط. قم بطرد المحلول مركزياً عند 500 RCF لمدة 35 دقيقة.

عند درجة حرارة من 20 إلى 25 درجة Celsius، يجب أن ينفصل الدم إلى ست نطاقات متميزة. هذه النطاقات الستة هي بلازما، وخلايا وحيدة النواة، ووسط العزل، والخلايا المتعادلة، ومزيد من وسط العزل، ورواسب كرات الدم الحمراء في القاع. إذا لم تكن هذه النطاقات الستة واضحة ومتميزة، فإن عملية الفصل لم تكن دقيقة ويتعين تكرارها.

تشمل الأسباب الشائعة لفشل الفصل استخدام وسائط عزل قديمة، أو تناول المتبرع للكحول خلال الـ 72 ساعة الماضية، أو تناول المتبرع لأدوية أخرى مثل Tylenol أو الأسبرين. قم بإزالة وطرح خلايا المونوسايت في البلازما ووسائط العزل بعناية. ضع هذه الطبقات في أنبوب قابل للإغلاق وتخلص منها، ثم اسحب بعناية باستخدام الماصة طبقة الخلايا المتعادلة (neutrophils) وجميع وسائط العزل الموجودة أسفلها إلى أنبوب طرد مركزي نظيف لاستعادة أكبر عدد ممكن من الخلايا المتعادلة.

غالبًا ما يكون من الأسهل تضمين بعض أوساط العزل من الطبقة الموجودة أدناه أيضًا. لا تقم بتعكير الراسب الموجود في القاع. الإجراء الثاني، تنقية طبقة الخلايا المتعادلة.

خفف محلول الخلايا المتعادلة إلى 10 milliliters باستخدام HBSS الخالي من الكالسيوم. اقلب الأنبوب عدة مرات لتعليق الخلايا، ثم قم بطرد محلول الخلايا المتعادلة مركزياً.

350 RCF لمدة 10 دقائق. عند درجة حرارة 20 إلى 25 درجة مئوية، يجب أن تظهر كريّة حمراء في قاع الأنبوب تحتوي على الخلايا المتعادلة وخلايا الدم الحمراء المتبقية. قم بإزالة السائل الطافي باستخدام الماصة.

توخَّ الحذر كي لا تزعزع الراسب الموجود في القاع عند تحلل خلايا الدم الحمراء.

يجب الآن تحليل خلايا الدم الحمراء الموجودة في العينة لتدميرها. ولتحليل خلايا الدم الحمراء المتبقية، أضف 2 mL من محلول تحليل خلايا الدم الحمراء إلى الأنبوب لإعادة التعليق. قم بتعليق الراسب ثم قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الـ vortex على إعداد من 3 إلى 4.

تجنب زيادة إعداد جهاز المزج الدوامي (vortex) فوق الدرجة الرابعة لأن ذلك قد يؤدي إلى تنشيط الخلايا المتعادلة (neutrophils). قد يكون من الضروري استخدام المزج الدوامي لعدة ثوانٍ أو استخدامه بنبضات متقطعة لإذابة الراسب. قم بطرد محلول التحلل مركزياً عند 250 RCF لمدة خمس دقائق.

استخدم خيار البدء الناعم (soft start) لتقليل الضرر الذي قد يلحق بالعينة. قم بإزالة الطافي باستخدام الماصة. كرر عملية التحلل.

عند الحاجة، لتحرير تعليق الخلايا المتعادلة (neutrophils)، أضف 500 µL من محلول HBSS الخالي من الكالسيوم إلى كل أنبوب. قم برج الراسب باستخدام جهاز Vortex على درجة تتراوح بين ثلاثة وأربعة، ثم خففه ليصل إلى 10 mL باستخدام HPSS الخالي من الكالسيوم ثم قم بالطرد المركزي. يتم طرد الخلايا المتعادلة عند 250 RCF لمدة خمس دقائق، ثم يتم سحب السائل الطافي والتخلص منه.

أعد تعليق الراسب في 250 µL من محلول HBSS مع HSA، حيث يتم عادةً جمع 2×10⁶ من الخلايا المتعادلة لكل ملليلتر.