Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

لقد وجدت تقنية زراعة الأنسجة تطبيقاً واسعاً في مجال بيولوجيا الخلية. ومع ذلك، تتطلب الخلايا المزروعة صيانة دورية لتبقى سليمة. وعندما تصل الخلايا إلى مرحلة الاندماج (confluency)، يجب إجراء عملية إعادة زراعة أو تمرير لها.

يؤدي عدم القيام بذلك إلى تراجع النمو وفي النهاية موت الخلايا. سنوضح في هذا الفيديو كيفية الحفاظ على خلايا الزراعة النسيجية لكل من خطوط الخلايا الملتصقة والمعلقة. مرحباً، أنا ريكي من مختبر د. LAN في شبكة مختبرات الباثولوجيا الجزيئية في شرق تينيسي.

أود اليوم أن أعرض لكم تقنيتين لنقل الخلايا العالقة والخلايا الملتصقة. لنقل طبق من الخلايا، سنبدأ بمزرعة أولية نمت حتى وصلت إلى حالة التلاقي الكامل في طبق بتري بقطر 60 مليمتر أو قارورة زراعة أنسجة بمساحة 25 سنتيمتر مربع تحتوي على 5 ملس من وسط زراعة الأنسجة.

نبدأ بإزالة جميع أوساط الزراعة من المزرعة الأولية باستخدام ماصة معقمة. بعد ذلك، نقوم بغسل الطبقة أحادية الخلايا الملتصقة مرة أو مرتين بحجم صغير من محلول HBSS عند درجة حرارة 37 درجة مئوية بدون الكالسيوم والمغنيسيوم؛ وذلك لإزالة أي بقايا من مصل العجل الجنيني التي قد تثبط عمل إنزيم التربسين الذي سيضاف في الخطوة التالية.

بعد ذلك، أضف كمية كافية من محلول trypsin EDTA الدافئ إلى المزرعة بحيث تغطي طبقة الخلايا الملتصقة. ثم يمكنك وضع الطبق على صينية تدفئة بدرجة حرارة 37 درجة Celsius لمدة دقيقة إلى دقيقتين. وبعد فترة التحضين، انقر على قاع الطبق فوق سطح مستوٍ لفصل الخلايا.

افحص المزرعة باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من أن الخلايا قد أصبحت مستديرة، مما يشير إلى انفصالها عن السطح. إذا لم تكن الخلايا منفصلة بشكل كافٍ، أعد الطبق إلى صينية التسخين لمدة دقيقة أو دقيقتين إضافيتين. بعد الفحص المجهري، اشطف الطبق باستخدام وسط غذائي كامل وانقل المعلق بواسطة الماصة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mil يحتوي على 2 mils من الوسط الغذائي الكامل.

قم بطرد الخلايا مركزياً لترسيبها، ثم أعد تعليق الراسب في وسط غذائي كامل. الآن، أضف حجماً مساوياً من معلق الخلايا إلى كل طبق من الأطباق الجديدة التي تم تمييزها بملصقات مناسبة. بدلاً من ذلك، يمكن عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) وتخفيفها للوصول إلى الكثافة المطلوبة بحيث يمكن إضافة عدد محدد من الخلايا إلى كل طبق.

تأكد من وضع ملصق على كل طبق يتضمن تاريخ المزرعة الفرعية ورقم الممر. بعد إضافة معلق الخلايا، أضف 1 ml من الوسط الغذائي الطازج إلى كل مزرعة جديدة. الآن، يتم تحضين الأطباق في حضانة رطبة عند 37 °C و5%CO2.

بعد تحضين الخلايا طوال الليل، أضف وسطاً غذائياً جديداً إلى الأطباق وأعدها إلى درجة حرارة 37 درجة. وبمجرد أن تصل الخلايا في الطبق إلى مرحلة الالتحام الكامل (confluency)، يمكنك تمرير الطبق مرة أخرى عن طريق تكرار هذا الإجراء والاستمرار في التمرير حسب الضرورة. سنوضح لكم الآن كيفية تمرير الخلايا في المزارع المعلقة.

تعد عملية تعبئة الخلايا في المزارع المعلقة أبسط منها في الخلايا الملتصقة. وقبل تعبئة المزارع المعلقة، يجب الحفاظ على الخلايا عن طريق التغذية كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تصل إلى مرحلة التلاقي، وهي المرحلة التي تتكتل فيها الخلايا معاً في المعلق ويظهر الوسط عكراً عند تحريك القارورة.

للقيام بذلك، أخرج قارورة الخلايا المعلقة من الحاضنة، مع الحرص على عدم تعكير الخلايا التي استقرت في قاع القارورة. وبطريقة معقمة، قم بإزالة والتخلص من حوالي ثلث الوسط من القارورة واستبدله بحجم مساوٍ من الوسط الذي تم تسخينه مسبقاً عند 37 درجة مئوية. بعد تغيير الوسط، قم بتدوير القارورة بلطف وأعدها إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5%CO2.

إذا كانت كمية الوسط في القارورة أقل من 15 مل، يتم تحضين القارورة في وضع أفقي لتعزيز تلامس الخلايا مع الوسط. وخلاف ذلك، يمكن تحضين القارورة عموديًا في الأيام التي لا يتم فيها تغذية المزارع. تحقق من الخلايا عن طريق تدوير القارورة لإعادة تعليق الخلايا.

تأكد من ملاحظة أي تغيرات في لون الوسط تشير إلى نمو أيضي جيد. وبمجرد أن تصبح المزارع متلاحمة، وهو ما يجب أن يكون حوالي 2.5 million cells per mil، يمكنك إجراء عملية النقل. ومرة أخرى، لقد عرضنا لك للتو كيفية نقل الخلايا المستزرعة لكل من المزارع الملتصقة والمزارع المعلقة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في جميع تجاربكم.