جيل من نخاع عظام الفئران الخلايا الجذعية المشتقة للاستخدام في 2 الفوتون التصوير

يوفر تحضير الخلايا الشجرية من نخاع العظم مصدراً ممتازاً للخلايا المقدمة للمستضد والتي يمكن استخدامها في التجارب المخبرية (in vitro) أو الحيوية (in vivo) في التصوير ثنائي الفوتون للجهاز المناعي. ويسمح إدخال الخلايا المقدمة للمستضد بدراسة التفاعلات الخلوية المحددة للمستضد في سياق العقدة اللمفاوية الحية. ونقوم هنا بتوضيح طرق العزل المعقم لنخاع العظم وتقنيات الزرع لإنتاج خلايا شجرية ناضجة.

علاوة على ذلك، نتتبع تطور الخلايا الشجرية من اليوم الأول وحتى اليوم الحادي عشر. ويتم تصوير هذا التطور من خلال صور ثابتة ومقاطع فيديو داخل الحاضنة تم إنتاجها باستخدام موقع scent technologies incus. وأخيرًا، نعرض الخلايا الشجرية المشتقة من نخاع العظم وهي تقدم مستضد cove إلى خلايا OT two T في العقدة الليمفاوية المرآتية.

مرحباً، أنا ميلاني ماثيو من مختبر ميكاه هالن في جامعة كاليفورنيا القريبة. هل تساءلت يوماً عما يحدث في الداخل أثناء عملية السبر بينما تنمو خلاياك؟ اليوم؟

كجزء من البروتوكول الخاص بنا، سنوضح لكم كيفية استخدام بعض الأجهزة في الموقع. يتيح لكم نظام Inky تتبع نمو المزارع الخلوية في الحاضنة الخاصة بكم. في هذا البروتوكول، سنوضح لكم كيفية عزل وتحضير الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم من الفأر.

أول شيء سأوضح لكم كيفية القيام به هو إزالة عظام الفخذ وعزل نخاع العظم. أولاً، قم بتثبيت الحيوان بالدبابيس. بعد ذلك، بلل الحيوان بـ 70% ethanol. قم بإجراء الشق الأول على طول الخط الناصف للحيوان.

بعد ذلك، قم بالقص من الجهة الداخلية للساق كما أوضح لكم هنا. ولكشف الأنسجة العضلية فوق عظمة الفخذ، يجب أن تكون قادرًا على إزاحة العضلات جانبًا والإمساك بعظمة الفخذ الكبيرة باستخدام ملقط التشريح. وبينما تمسك بالعظمة بملقط التشريح، تحرك للأسفل على طول العظمة وقم بإجراء القص الأول أسفل المفصل مباشرةً.

بعد ذلك، حرك المقص على طول عظمة الفخذ وقم بالقص في أقرب نقطة ممكنة من الجسم. قد يؤدي ذلك إلى نزيف بسيط، خاصة إذا قمت بقطع الشريان الفخذي. وعند إزالة عظمة الفخذ، من المهم للغاية الحفاظ على سلامة العظمة دون تلف.

كما تلاحظون هنا، فإن أطراف العظمة لم تُقطع أو تُتلف. بمجرد إزالة عظمة الفخذ، قم بقص أي أنسجة إضافية وضع عظمة الفخذ في طبق صغير يحتوي على وسط PMI الخاص بنا. عند إزالة الأنسجة الإضافية، تأكد من عدم جفاف عظمة الفخذ.

في هذه المرحلة، يجب نقل عظام الفخذ إلى طبق يحتوي على 70% ethanol ووضعها على الثلج لمدة تتراوح من خمس إلى 10 دقائق. ولأغراض هذا الفيديو، سنواصل العمل على طاولة المختبر، ومع ذلك، يجب في هذه المرحلة من التجربة نقل كل شيء إلى غطاء استنبات الأنسجة (tissue culture hood).

بمجرد نقع العظام في الإيثانول، يمكنك نقلها إلى طبق أكبر يحتوي على وسط استزراع معقم لإزالة نخاع العظم. والآن نحن مستعدون لإزالة نخاع العظم وإعادة تعليقه. املأ محقنة إنسولين بوسط استزراع معقم وضعها جانباً لاستخدامها لاحقاً.

أمسك العظمة باستخدام الملاقط المعقمة. ثبتها فوق طبق صغير للتخلص من القطع الزائدة، ثم اقطع المشاشة أو أطراف العظمة من كل جانب. أدخل سرنجة الإنسولين في أحد جانبي العظمة واغسل النخاع لإخراجه من العظمة في 15 mils من الوسط الزرعي.

اغسل العظمة مرة أو مرتين إضافيتين حتى يتم تفريغ كل النخاع. بمجرد تفريغ النخاع من العظمة، ستصبح بيضاء اللون بالكامل تقريباً. ضع العظمة النظيفة في وعاء النفايات وكرر العملية مع عظمة الفخذ الأخرى.

بمجرد الانتهاء من ذلك، قم بتفكيك أي قطع من النخاع لم يتم تفتيتها أثناء عملية الغسيل بلطف لإنشاء معلق خلوي أحادي. ستستغرق عملية السحب والضخ بالمصّة من 5 إلى 10 دقائق. ضع المعلق الخلوي الأحادي في أنبوبة مخروطية سعة 50 ml، واغسل الطبق ثلاث مرات على الأقل باستخدام 10 ml من الوسط الزرعي.

في كل مرة، قم بتركيز الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم تخلص من الوسط الغذائي وأعد تعليق الخلايا عن طريق تحريك أصابعك بقوة وبسرعة مقابل قاع الأنبوب. ولإزالة خلايا الدم الحمراء أو RBCs، نقوم بإجراء تحلل مائي. وهناك طريقة أخرى لإزالة خلايا الدم الحمراء وهي التحلل باستخدام كلوريد الأمونيوم.

لقد تم وصف كلتا الطريقتين في مقالات فيديو سابقة من JoVE. عزل الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 من العقد اللمفاوية للفئران باستخدام Milan max purification JoVE issue nine، وتحضير عامل نمو الخلايا التائية من خلايا الجرذان JoVE. Issue 10.

بعد إزالة خلايا RBCs، أصبحتم الآن مستعدين لزراعة الخلايا. لذا، وقبل أن أصحبكم في عملية زراعة الخلايا الشجرية، أود أن أعرفكم على موقع incus. سيتيح موقع incus تتبع نمو زراعة الخلايا التنبؤية داخل الحاضنة، بحيث يمكننا مراقبة الخلايا ومعرفة كيفية سلوكها أو أي خلل قد يطرأ عليها.

بمجرد إعداد المزرعة، توضع في صينية ذات حجم مناسب ويتم إغلاق موقع جهاز Incucyte. بعد ذلك، تقوم ببساطة عبر جهاز الكمبيوتر بتحديد الفاصل الزمني ثم اختيار الآبار التي ترغب في تصويرها، وتترك جهاز Incucyte يقوم بجمع البيانات نيابة عنك. ستوضح لك المقاطع المرئية في هذا البروتوكول التغيرات المورفولوجية للخلايا الشجرية في المختبر (in vitro).

تم تصدير هذه الفيديوهات مباشرة من برنامج موقع Incus. ومع تطور الخلايا التغصنية من اليوم الأول إلى اليوم الحادي عشر، يمكنك ملاحظة تغير حقيقي في المورفولوجيا حيث تزداد الخلايا حجماً وتكتسب النمط الظاهري للخلايا التغصنية. وبعد تحلل كريات الدم الحمراء وإزالتها، يتم غسل الخلايا في وسط زراعة الخلايا التغصنية الأولية ثم تُنشر بكثافة 5 million لكل مل.

يجب زراعة هذه الخلايا في البداية في أوساط زراعة الخلايا التغصنية الأولية، ثم نزرعها لاحقاً في أوساط زراعة الخلايا التغصنية الثانوية، والمُدعمة بـ 40 nanograms per mil من IL four و100 nanograms per mil من TNF alpha. ستساعد هذه السيتوكينات في تطوير خلايا تغصنية ناضجة تشبه الخلايا التغصنية المشتقة من الخلايا الوحيدة. سأعرض لكم الآن كيف تبدو المزارع أثناء تطورها وكيفية الحفاظ عليها بمرور الوقت.

بمجرد الانتهاء من زراعة الخلايا في الأطباق، يمكنك استزراع الخلايا الشجرية لمدة 72 ساعة قبل إجراء أول عملية تغيير للوسط الغذائي. إليك كيف سيبدو المزرعة النموذجية مباشرة بعد زراعة الخلايا في اليوم الأول. وهنا نظرة فاحصة على الخلايا.

في اليوم الثالث، يمكنك ملاحظة أن الخلايا قد بدأت في الالتصاق بالطبق، لكنها لم تكتسب بعد النمط الظاهري الكلاسيكي للخلايا الشجرية. وفي اليوم الرابع، يتم إزالة الوسط وإضافة 10 mils من وسط الخلايا الشجرية الأولي الطازج عن طريق شفط الوسط. وفي اليوم الرابع، سنقوم بإزالة الخلايا اللمفاوية وأي خلايا أخرى غير ملتصقة.

يمكنكم الآن إعادة العينات إلى الحاضنة لمدة ثلاثة أيام أخرى، أي بعد سبعة أيام من عملية الزرع الأولية. إليكم المظهر النموذجي للمزرعة؛ حيث يمكنك معرفة أن الوقت قد حان لتقسيم الخلايا وإعادة زرعها.

في اليوم السابع، يتم إزالة الخلايا التغصنية من الطبق عن طريق شفط الوسط، ثم إضافة 300 millimolar من EDTA المعقم والتحضين لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم شطف الطبق بشكل متكرر عن طريق إمالته بزاوية 45 درجة واستخدام الماصة لتوجيه محلول EDTA نحو الجزء الخلفي من الطبق. وتستمر هذه العملية لعدة دقائق لضمان إزالة جميع الخلايا التغصنية الملتصقة.

تُجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 mL وتُغسل مرتين باستخدام وسط DC الثانوي. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق الخلايا وزراعتها بكثافة 5 مليون خلية لكل طبق. وتترسب الخلايا التغصنية في اليوم السابع التي تمت إعادة زراعتها حديثاً بسرعة في قاع الطبق، حيث تلتصق وتبدأ في الانتشار.

كما يمكنكم أن تروا هنا في فيديو موقع Zichy، فقد تم تصوير هذا الفيديو داخل الحاضنة على مدار يومين لإظهار تطور الخلايا الشجرية بدءاً من عملية إعادة الزرع الأولية التي تمت في اليوم السابع وحتى بداية اليوم التاسع. يمكن تنشيط الخلايا الشجرية من حيث المورفولوجيا عبر نبض المستضد عن طريق إضافة 2 µg/mL من LPS هنا مع 100 µg من ova للاستخدام مع خلايا T المنقاة من فئران OT two، والتي تمتلك خلايا T موجبة لـ CD4 محددة لـ ova. إذا كنت تستخدم مستضداً مختلفاً، فمن المهم التأكد من استخدام تركيز مثالي من المستضد لنبض الخلايا الشجرية (dcs) هنا؛ حيث يتم إضافة OV و LPS إلى الوسط الأساسي بحيث يكون التركيز النهائي لـ LPS هو 2 µg/mL في 20 mL، و ova بتركيز 100 µg/mL في 20 mL.

إليك صورة توضح شكل مستنبت نمطي للخلايا الغصنية في اليوم 10. يمكنك أن ترى في هذه الصورة أن المورفولوجيا نموذجية جداً لخلية مقدمة للمستضد. يجب عليك دائماً التحقق من نسبة الخلايا الغصنية الموجبة لـ CD 11 C عن طريق تقنية FACS.

يتم ذلك لضمان حصولك على مزرعة نقية نسبياً من الخلايا الشجرية لاستخدامها في تجاربك. نستخدم هنا موقع inky من شركة SEN instruments لمراقبة تنشيط الخلايا الشجرية التي عولجت بـ LPS ونبضت بالمستضد في اليوم 10. يغطي هذا الفيديو فترة 24 ساعة مباشرة بعد إضافة LPS والببتيد، وتصبح فيه الخلايا الشجرية أكثر نشاطاً مع ظهور بعض التغيرات المورفولوجية الواضحة.

بمجرد تنشيط الخلايا الغصنية في نبضة المستضد، يمكنك جمعها مرة أخرى عن طريق التحضين مع 300 millimolar EDTA وغسل الطبق. الآن قم بطرد الخلايا مركزياً، واغسلها مرتين باستخدام 50 mils من وسط RPMI لإزالة أي مستضد إضافي، ثم قم بتمييزها بصبغة تتبع الخلايا المناسبة. في هذه التجربة، سأقوم بتصوير الخلايا في العقدة الليمفاوية الأربية.

سنحتاج إلى حقن ما بين مليونين إلى 5 ملايين من الخلايا الشجرية في الجلد في منطقة الخاصرة للفأر الموضح هنا. بعد ذلك، نترك الخلايا الشجرية لمدة 24 ساعة لتنتقل إلى العقدة الليمفاوية التدريبية. في هذا الفيديو، تم وسم الخلايا الشجرية بـ CMF two hc، وهو صبغ تتبع خلوي أزرق.

يمكنكم رؤية الخلايا التغصنية وهي تتفاعل مع خلايا T الموصومة والمحددة لمستضد volin. هذه الخلايا T موصومة بـ ccf SE. كما يمكنكم استخدام C-M-T-M-R أو أي من صبغات تتبع الخلايا الأخرى كمسابير جزيئية. تمثل هذه الحالة مرحلة التنشيط المبكرة لخلايا T المتفاعلة مع الخلايا التغصنية.

نظراً لكونها متخصصة في مستضد معين، يمكنك ملاحظة أن الخلايا التائية تلتصق بزائِدات الخلايا الشجرية المصبوغة باللون الأزرق. بهذا نختتم البروتوكول الذي يوضح تحضير واستخدام الخلايا الشجرية المشتقة من نخاع العظم للفئران في تجربة تصوير ثنائية الأزرار. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم الخاصة.