الجزيئية تطور Recombinase تري

اسمي فرانك ألز، وأنا قائد مجموعة في معهد ماكس بلانك لبيولوجيا وعلم وراثة الخلايا البقعية في دريسدن. سأتحدث الآن عن عملنا في تطوير إنزيم ريكومبينيز محدد الموقع للجراحة الجزيئية.

تتمثل الغاية الأساسية في استخدامها كأداة لتمكين استئصال تتابعات، وتحديداً تتابعات محددة مسبقاً من الجينوم، وبشكل أكثر دقة لمحاولة استئصال الخلايا المصابة بـ HIV من الفيروس. لذا، الهدف أساساً هو استئصال الفيروس المدمج HIV من جينوم الخلايا المصابة. أما من الناحية التصورية، فإننا نقوم بتكييف أداة جينية راسخة بالفعل، وهي إنزيم Cree Recombinase، للارتباط والتعرف على موقع مستهدف نحدده مسبقاً واستخدامه.

لذلك، سعينا إلى معرفة ما إذا كان بإمكاننا إنشاء إنزيم ريكومبينيز (recombinase) محدد الموقع، يرتبط بموقع يتواجد طبيعياً في منطقة LTR لفيروس HIV. وتوقعنا أنه إذا تمكنا من تحقيق ذلك، فسيكون من الممكن حينئذٍ استئصال البروفيروس (provirus) من الجينوم. تمر دورة حياة الفيروس بشكل أساسي بمرحلة يتكامل فيها الفيروس في الخلايا، ثم يقوم عبر عملية النسخ العكسي بتكوين قالب DNA محاط بتكرارين طرفيين.

تُسمى هذه التكرارات الطرفية الطويلة أو LTRs القصيرة. ثم يتم نقلها إلى النواة حيث تندمج بشكل عشوائي تقريباً في جينوم العائل. وهكذا يصبح لديك الآن حالة وجود ما يسمى بالفيروس الخامل (provirus)، وهو مدمج ومحاط بتكرارين طرفيين طويلين، أي بتكرارين من نوع LTRs.

كان المفهوم حينها هو أنه إذا تمكنا من جعل إنزيم ريكومبينيز (recombinase) يتعرف على تسلسل موجود في منطقة LTR، فسنتمكن من استئصال الفيروس المندمج كحلقة من جينوم المضيف، وبالتالي القضاء على الفيروس من الخلايا. كانت هذه هي الفكرة المفاهيمية. وحقيقةً، فإن الريكومبينيز هو بروتين مرتبط بالـ DNA ويحدد موقعاً محدداً للغاية.

وبذلك فإنه يحتوي على نطاق ربط بالـ DNA، والذي يتعرف على تسلسل معين داخل الـ DNA. ولا ينشط الإنزيم إلا عندما يجد هذا التسلسل بدقة، ولا يكون نشطاً في أي من التسلسلات الأخرى.

تُعرف مبادئ التطور الجزيئي بشكل أساسي من قبل الجميع لأنها لا تعدو كونها عملية تربية. فمبدأ التطور الجزيئي هو أنك تُحدث طفرات، ثم تخضع لعملية انتخاب، ومن ثم تختار خاصية معينة. وهذا يماثل تماماً ما يتم القيام به في تربية النباتات.

أنت تعلم أنك تريد حجماً معيناً أو لوناً معيناً، ومن ثم تختار دائماً للجيل القادم السلالات التي تمتلك سمات محددة وتبدأ في تزويجها لبعضها البعض. وهذا هو بالضبط ما نفعله مع الجزيئات. لذا، فإن الأمر ينطبق أساساً على كل شيء ولكن على نطاق صغير.

نبدأ بإنزيم يتمتع بنشاط معين، وهو في حالتنا هذه إنزيم CRE recombinase، ثم نبدأ ببروتين من النوع البري. نقوم بعد ذلك بإحداث طفرة طفيفة في الموقع الذي يرتبط به هذا الـ recombinase، مما يجعله يحتفظ بنشاط منخفض للغاية. ثم نقوم بإدخال طفرات عشوائية في الإنزيم، أي في الـ recombinase، ونختار الطفرات التي تصبح الآن قادرة على الارتباط بهذا الموقع المتحور.

بمجرد حصولنا على ذلك، يمكننا بعد ذلك دمج الطفرات المختلفة معاً للوصول في النهاية إلى المنتج النهائي الذي نرغب في الحصول عليه، بحيث يتعرف إنزيم الريكومبيناز (recombinase) على التسلسل الذي حددناه في منطقة LTR. لذا نبدأ، كما ذكرت، بمكتبة عشوائية من الطفرات، ويتم ذلك عادةً عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المعرض للأخطاء.

لذلك نستخدم ظروف PCR، والتي تجعل إنزيم polymerase مثلاً يرتكب الكثير من الأخطاء. وبهذه الطريقة ننشئ مكتبة عشوائية تحمل طفرات في أماكن متفرقة. يمكننا أيضاً استخدام سلالة مُطَفِّرة، أي سلالة بكتيرية مُطَفِّرة، والتي تستحث أو تُدخل العديد من الطفرات في نسخ نسخ معينة.

وتُستخدم هذه المواد بعد ذلك كمادة بداية. أما التقنية الأخرى التي نستخدمها، فهي تقنية إعادة خلط الحمض النووي (DNA shuffling) بعد فترة من الزمن. وهي في الأساس تقنية تسمح لك بدمج طفرات مفيدة مختلفة، لأنك لا تعرف حقاً أي من هذه الطفرات هو المفيد، ولكن سيكون لديك طفرات مختلفة تحمل طفرات متباينة.

إذًا لديك جين واحد به طفرة هنا، وهي طفرة مفيدة. ولديك مستنسخ ثانٍ به طفرة هنا، ومن أجل الجمع بينهما، تقوم الآن بإجراء تفتيت عشوائي للقطع المختلفة، ثم تجمع هذه القطع في تفاعل PCR لإعادة تجميع النواتج. والآن، ستحصل بتردد معين على تركيبة من الاثنين، حيث يتكون جزء من إعادة الائتلاف من هذا المتحور وجزء آخر من هذا المتحور.

ومن ثم سيكون لهذا الشخص هنا تأثير إضافي من شأنه تحسين، وسوف تتمكن، ستتمكن من اختيار المرشحين الذين يمتلكون الخصائص المطلوبة بشكل أسرع بكثير. لذا سأقوم بوضع التعريف حيث أذكر أن البروتين من النوع البري ليس له أي نشاط على الإطلاق في موقع معين. لذا، إذا أخذنا على سبيل المثال التسلسل الذي اخترناه من LTR من HIV-LTR، وإذا جربنا cre recombinase على هذا التسلسل، فلن يكون هناك أي نشاط على الإطلاق.

إن إنزيم CRE recombinase غير قادر على إعادة تركيب الموقع، وبناءً على التعريف، سأقول إن لديك إنزيم ريكومبينيز جديد عندما يصبح لديك إنزيم قادر على الارتباط بهذا التسلسل وإعادة تركيبه. لم نحدد مسبقاً عدد الدورات التي سنقوم بها، ولكننا أجرينا عدداً من الدورات حسبما كان ضرورياً حتى حصلنا على إنزيم يتمتع بالنشاط الذي نريده. لذا بدأنا بطفرات بسيطة جداً في الموقع، ثم بدأنا بدمج الطفرات المختلفة معاً.

كانت هذه إحدى الخطوات المهمة التي تفسر سبب نجاح هذه العملية. لذا فقد مررنا بمراحل وسيطة وكان علينا اجتياز العديد من الدورات للعثور على إنزيم يكون نشطًا بما يكفي للانتقال إلى الدورة التالية. وهذا يشبه إلى حد كبير أي عملية تربية وتحسين سلالات.

تقوم بتحديد نشاط معين ترغب فيه، وميزة معينة تريدها، ثم تبدأ في عملية التربية. وإلى أن تحصل على النتيجة التي كنت تطمح إليها، فإنك لا تكون قد وصلت لهدفك، ويتوجب عليك إجراء المزيد من الأجيال. هذا هو الوضع باختصار.

ويجب أن أذكر أيضاً أن دورات التطور التي بلغت 120 دورة، أو مائة وثمانية وعشرين ستة على وجه الدقة، كانت تهدف فقط للعثور على خطوة وسيطة لنقول عندها إن بإمكاننا التوقف لأننا حصلنا على بعض النشاط. إن عمليات إعادة الاتحاد التي لدينا الآن لا تزال أقل نشاطاً من إنزيم CRE recombinase في صورته البرية. لذا، ومن أجل الحصول على إنزيم إعادة اتحاد أكثر نشاطاً، سيتعين علينا إجراء المزيد من دورات التطور.

لذا، هي لا تنتهي أساساً عند النقطة التي وصلنا إليها الآن فيما يتعلق بعملية التطور. لا أرى أي قيود تقنية، ولكن يبقى التساؤل حول المدى الذي يمكن الوصول إليه عند المضي قدماً في هذا الأمر.

لذا، بالنسبة لجانب LTR، فإن التسلسل الموجود في LTR HA يتشارك في تشابه تسلسلي بنسبة 50% مع جانب LTR الطبيعي، وهو الجانب الطبيعي الذي يتعرف عليه إنزيم recombinase. لذا فإن السؤال هو، هل يمكن للمرء المضي قدماً في ذلك، ونحن لا نعرف هذا بعد، ولكن حقيقة أننا نملك تشابهاً تسلسلياً بنسبة 50% فقط مع الموقع البري تشير إلى أنه يمكنك دفع هذا الأمر إلى حد أبعد. يعمل إنزيم recombinase بشكل جيد في خلايا المزرعة النسيجية البشرية، على الرغم من أنه، كما ذكرت، ليس بنشاط إنزيم query recombinase عند عمله على موقعه الخاص.

لذا، فمن المرجح أن الاستقرار أقل إلى حد ما مما هو عليه في ريكومبيناز الاستعلام، الإنزيم من النوع البري، وسيكون من الضروري إجراء المزيد من الانتقاء ودورات تطوير إضافية لتحسين هذه الخصائص في المستقبل. لذا فإن الخطوة الأولى تتمثل في تحسين الموقع، وهذا الريكومبيناز تحديداً، ريكومبيناز الثلاثي، لجعله أكثر نشاطاً، وربما البحث عن مواقع أخرى بارزة جداً لتكون أهدافاً جيدة في LTR وإيجاد ريكومبيناز فعال جداً لهذا الغرض. بعد ذلك، سيتعين علينا اختبار هذا الريكومبيناز في فحوصات مختلفة، أولاً مرة أخرى في خلايا المزرعة النسيجية، ولكن من المهم جداً بعد ذلك اختبار هذا الريكومبيناز في نماذج حيوانية.

لذلك، سيتعين علينا التحقق مما إذا كان لهذا الإنزيم المؤتلف أي آثار جانبية غير مرغوب فيها داخل الكائن الحي. ومن ثم، وبالطبع، يمثل تطوير نظام توصيل فعال لهذا الإنزيم المؤتلف جانبًا صعبًا للغاية، وهو أمر ليس بالهين، بل يُعد مجالاً بحثياً قائماً بذاته لتطويره.

لقد كان في الأساس نهجاً للعلاج الجيني يتعين علينا اتباعه. حسنًا، أعتقد أننا نشهد تحولاً في الطب نحو التوجه الجزيئي بشكل متزايد. وبالطبع، نحتاج من أجل ذلك إلى أدوات تمكننا من العمل على مثل هذا النطاق.

وهنا أرى مستقبل عملية التطور. لذا، نحتاج إلى تصنيع إنزيمات مخصصة تعمل وفق آلية نود حقاً القدرة على استخدامها؛ وفي حالة الـ recombinase، ربما يمكن اعتبار ذلك تشبيهاً بأداة يستخدمها الجراح الذي يحتاج إلى استئصال شيء ما أثناء العملية. لذا، نحن بحاجة الآن إلى أدوات تمكن الجراح الجزيئي، بشكل أساسي، من استئصال قطعة معينة من الـ DNA من الجينوم بدقة.

ولهذا الغرض، يحتاج إلى الأدوات التي تمكنه من القيام بذلك. لذا يمكن للتطور الجزيئي أساساً أن يؤدي هذه الوظيفة. توجد العديد من الإنزيمات في الطبيعة والتي تمتلك خصائص مرغوبة للغاية تمكنها من القيام بهذا الأمر.

يتعين علينا فقط تطويعها وفقاً لاحتياجاتنا لكي نتمكن من جعلها مفيدة. وأعتقد أن التطور الجزيئي يمكن أن يلعب دوراً هاماً جداً هنا. أما فيما يخص مواضع القصور، فمن الصعب تحديدها في الوقت الحالي لأن هذه التقنية، أو هذا المجال، لا يزال في بداياته.

لذا سيكشف الوقت عن مواضع القصور؛ وأنا واثق من وجود بعضها، ولكن في الوقت الحالي، أعتقد أن الفرص المتاحة تفوق القيود الموجودة.