توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

تُعد دودة *Caenorhabditis elegans* كائناً نموذجياً مفيداً للغاية نظراً لمعرفتنا بسلالاتها الخلوية، بالإضافة إلى وفرة المعلومات الناتجة عن تسلسل وتحليل جينومها الكامل. في هذا الفيديو، سنوضح عملية الحقن المجهري للبلازميدات في دودة *C. elegans* واختيار النسل المعدل وراثياً باستخدام المجهر الفلوري؛ وبما أن دودة *C. elegans* حيوان شفاف ومتعدد الخلايا، فهي مثالية لتصور الجينات المنقولة التي تعبر عن بروتينات موسومة فلورياً في الجسم الحي. مرحباً، اسمي لورا بيركويتز، وأنا باحثة مشاركة في مختبر كولدويل بقسم العلوم البيولوجية هنا في جامعة ألاباما.

وأنا آدم نايت، من مختبر كالويل أيضاً في جامعة ألاباما. سأوضح لكم اليوم كيفية التحضير لعملية الحقن المجهري للبلازميد (Plasmid Microinjection) لإنتاج ديدان *C. elegans* معدلة وراثياً، كما سأبين لكم كيفية اختيار وسلالات *C. elegans* المعدلة وراثياً والحفاظ عليها. لذا، فلنبدأ.

قبل البدء في عملية الحقن المجهري، هناك بعض خطوات التحضير التي سأوضحها لكم الآن. أولاً، قم بتحضير الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) المراد حقنه؛ حيث يلزم بلازميدان، أحدهما يشفر التعبير النسيجي النوعي للجين المستهدف، والثاني يوفر علامة اختيار للتحول. اخلط البلازميدات معاً بنسبة واحد إلى واحد بتركيز 50 nanograms لكل µL.

بعد ذلك، قم بتحضير وسادات التثبيت (auger pads)، والتي ستُستخدم لتثبيت الديدان أثناء الحقن.لصنع وسادات التثبيت، ضع أولاً عدة شرائح غطاء زجاجي بمقاس 22 × 50 ملم على سطح المختبر. وباستخدام ماصة باستور، ضع قطرة من مادة 2%agros المصهورة على إحدى الشرائح الزجاجية، ثم ضع فوراً شريحة زجاجية ثانية فوق القطرة بزاوية 90 درجة بالنسبة للشريحة الأولى.

اترك الهلام يتصلب لبضع ثوانٍ ثم قم بإزالة غطاء الزجاج العلوي. يجب أن يتراوح قطر القرص المسطح من الهلام بين 15 و20 مليمترًا. اترك الوسادة لتجف تمامًا في الهواء لعدة ساعات أو طوال الليل.

بمجرد أن تجف، تُخزن الوسادات في صندوق شرائح غطائية في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتجهيز أدوات تحميل الإبر لمحلول DNA. وللقيام بذلك، خذ أنبوباً شعرياً بسعة 100 µL وسخنه من المنتصف باستخدام لهب مكشوف، ثم اسحبه بسرعة ليصل طوله إلى ضعف طوله تقريباً.

بمجرد أن يبرد الأنبوب الشعري، اكسر النصفين بعيداً عن بعضهما. قم بتجهيز من 10 إلى 20 من أدوات تحميل الإبر لعملية الحقن. يمكنك تخزينها بشكل رأسي في أنبوب طرد مركزي دقيق.

يا براك، كن حذراً. رؤوس أداة تحميل الإبر حادة جداً. الآن، قم بتجهيز إبر الحقن المجهري.

تُصنع هذه الإبر من أنبوب شعري خاص يحتوي على فتيلة زجاجية داخلية. وتعمل هذه الفتيلة كفتيلة لسحب محلول DNA. ولصناعة الإبر، نستخدم جهاز Niki PP eight 30 Polar مع ضبط الحرارة عند 24.8، حيث يتم سحب عدة إبر في المرة الواحدة من أجل التخزين.

يمكن تثبيت عدة إبر على شريط من صلصال النمذجة. ستُستخدم شظايا صغيرة من غطاء الشريحة الزجاجية لكسر طرف الإبرة المسحوبة. يتم تحضير هذه الشظايا عن طريق لف غطاء شريحة زجاجية بمقاس 18 by 18 millimeter في منديل Kim wipe والضغط عليه برفق حتى يتكسر إلى عدة قطع.

استخدم شظايا يبلغ حجمها حوالي 3 × 4 ملم. وبالإضافة إلى تحضير الـ DNA والإبر، قم بتحضير ما يقرب من 50 إلى 100 من الديدان في مراحل نمو مناسبة. يتم تحضير ديدان من النوع البري (wild type) بعدد اثنتين لكل بنية ناقل تعبير (expression vector construct) سيتم حقنها.

نحن الآن مستعدون لإعداد مجهر الحقن المجهري. لبدء إعداد المجهر، افتح الصمام الرئيسي في خزان الهيليوم المتصل بذراع وحامل إبرة الحقن المجهري. أغلق المنظم للسماح للغاز بالدخول إلى الخط.

عندما يصل الضغط إلى 35 PSI، يمكن تحرير الغاز باستخدام دواسة قدم. بعد ذلك، أدخل محمل الإبرة في أنبوب ماصة فموية قياسية وأسقط كمية صغيرة من خليط البلازميد تبلغ حوالي 1 µL. الآن، أدخل المحمل برفق عبر إبرة الحقن المجهري بالكامل حتى تشعر بالمقاومة.

قم بطرد محلول DNA عن طريق النفخ برفق ثم قم بإزالة أداة التحميل. وبمجرد تحميل DNA، أدخل الإبرة في ذراع الحقن المجهري، مع الحرص على وضعها داخل الحاشية المطاطية الداخلية الصغيرة، ثم قم بتثبيتها في ذراع جهاز المناولة. بعد ذلك، ضع شظية من غطاء الزجاج لكسر الإبرة على إحدى حواف وسادة المثقاب.

قم بتغطية الشظية وكذلك السطح الكامل للوسادة المفرغة بزيت الكربون المجوف. ثم ضع الوسادة المفرغة على منصة مجهر مقلوب. بعد استقرار الوسادة المفرغة في مكانها، قم بتحديد موضع الإبرة في مركز مجال الرؤية باستخدام عدسة Forex والإضاءة ذات المجال الساطع، ولكن لا تقم بخفضها في الزيت بعد.

بعد ذلك، قم بوضع الحافة الداخلية لشظية غطاء الشريحة في المركز، ثم ركز عليها. اخفض الإبرة في الزيت، بحيث تصبح في نفس المستوى البؤري لشظية غطاء الشريحة. ارفع قوة التكبير عن طريق الانتقال إلى العدسة الشيئية 40 x، ثم أعد التركيز على حافة الشظية وأعد وضع طرف الإبرة إذا لزم الأمر.

الآن، قم بكسر طرف إبرة الحقن. ادفع الإبرة برفق مقابل حافة شظية غطاء الزجاج، وفي الوقت ذاته، قم بتطبيق نبضة قصيرة من الغاز عبر دواسة القدم. ستنكسر الإبرة بشكل كافٍ.

لا يُفضل هروب قطرات صغيرة من السائل من طرف الإبرة نتيجة التدفق المفرط للسائل بسبب كبر الفتحة، لأن ذلك سيؤدي إلى موت الحيوانات. وبمجرد أن تصبح الإبرة جاهزة، نبدأ عملية الحقن المجهري. بعد ذلك، قم بإزالة وسادة المثقاب من المنصة عن طريق رفع الإبرة للأعلى.

ولكن لا تغير موضع المحور X أو Y. اسحب المنصة إلى الخارج من تحت الإبرة. قم بإزالة وسادة المثقاب ووضعها تحت مجهر تشريحي.

انقل الدودة إلى الوسادة أسفل سطح الزيت. إذا تلوت الدودة، فقم بمسحها بلطف حتى تلامس وسادة المثقاب، حيث يجب أن تلتصق الدودة الرطبة بالمثقاب الجاف. ضع وسادة المثقاب بسرعة مرة أخرى على المنصة، مع توسيط الدودة في مجال الرؤية.

بعد ذلك، اخفض الإبرة لتصبح في نفس مستوى تركيز الدودة. قم بتغيير الفلاتر في المجهر المقلوب إلى إضاءة Hoffman. يسمح فلتر التباين هذا بظهور التفاصيل المورفولوجية للدودة.

باستخدام العدسة الشيئية 40x، قم بالتركيز على المركز الحسي الحبيبي لمناسل الدودة الموجود أسفل النمط الشبيه بقرص العسل لنوى الخلايا الجرثومية. اختر أي من المناسل الموجودة على جانب الدودة المواجه للإبرة. قم بضبط موضع الإبرة بدقة حتى يصبح الطرف أيضاً في بؤرة التركيز.

أدخل الإبرة برفق في مركز الغدة التناسلية، ثم طبق نبضة قصيرة من ضغط الغاز لطرد قطرة أو قطرتين من الـ DNA إلى ذراع الغدة التناسلية. ومع الكثير من الممارسة والمهارة، ستتمكن من ملاحظة موجة من السائل تنتشر عبر الجزء القاصي من الغدة، وستتمكن من إصابة مركز الغدة في كل مرة.

ضع في اعتبارك أنه من المهم العمل بسرعة أثناء حقن الدودة، حيث يمكن أن تتعرض للجفاف بسهولة. لذا، يجب أن تستغرق العملية بأكملها من الناحية المثالية أقل من دقيقة إلى دقيقتين.

بمجرد اكتمال عملية الحقن، قم بإزالة وسادة البرغي من المنصة ووضعها تحت مجهر التشريح. ضع 1 µL من منظم M9 مباشرة على الدودة المحقونة. قد يتطلب ذلك غمر طرف الماصة تحت سطح زيت halo carb.

يجب أن يعمل المحلول المنظم على إعادة ترطيب الدودة، ومن ثم ستطفو بعيداً عن سطح لوحة aeros؛ انقل الدودة إلى طبق عادي باستخدام أداة التقاط الديدان. والآن سأسلم الديدان المحقونة إلى Adam الذي سيوضح لنا كيفية اختيار السلالات المعدلة وراثياً والحفاظ عليها. تُنقل الديدان المحقونة إلى أطباق منفردة مقاس 60 ملم مزروعة حديثاً وتُترك لتتكاثر.

تمثل هذه الديدان الجيل P zero. عادة ما يتم تحضين الحيوانات المحقونة عند 20 درجة Celsius لمدة تتراوح من يومين إلى ثلاثة أيام حتى تظهر النسل. وبمجرد ظهور النسل، نصبح مستعدين لبدء فحص الديدان المعدلة وراثياً.

يتم فحص نسل الجيل الأول F1 للبحث عن دليل على وجود الوسم المعدل وراثياً. وفي هذه الحالة، يكون الوسم القابل للاختيار فلورياً، لذا يمكننا الفرز باستخدام مجهر ستيريو فلوري. يتم استنساخ كل حيوان حامل للفلورة من الجيل الأول F1 بشكل منفصل في طبق جديد.

قد يُنتج الـ P zero المحقون من واحد إلى خمسة من النسل الفلوري فقط من بين جميع أفراد الـ F1 الخاصة به. تُترك خنازير الـ F1 الخنثى للتكاثر عند 20 درجة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى يظهر النسل. وبمجرد أن يصبح جيل F two جاهزاً، يتم فحصهم أيضاً بحثاً عن الحيوانات المعدلة وراثياً. وتُعتبر حيوانات F two التي ورثت وعبرت عن علامة معدلة وراثياً سلالة مستقرة.

يجب الحفاظ على كل سلالة مستقرة ومستقلة كسلالة منفصلة من الديدان، ويتم إكثار كل سلالة عن طريق نقل عدة حيوانات معدلة وراثياً إلى طبق جديد في كل جيل. يجب إجراء هذه العملية باستخدام مجهر ستيريو فلوري. إذا كان المؤشر القابل للاختيار فلورياً، فمن أجل ضبط التباين في عدد نسخ الجينات، يجب إنشاء ثلاث سلالات مستقرة ومستقلة على الأقل لكل بناء جيني تم حقنه.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية الحقن المجهري لبنى ناقلات التعبير، ورؤية الـ elgan، واختيار السلالات المستقرة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.