تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

في مختبر كالدول، المعروف أيضاً باسم "كوخ الديدان"، ندرس آليات الأمراض العصبية في ديدان *C. elegans*. وبعد يوم طويل من التجارب المثمرة، نكافئ أنفسنا ببعض الأنشطة الترفيهية. مرحباً، أنا آدم نايت، طالب جامعي من مختبر كالدول في قسم العلوم البيولوجية بجامعة ألاباما.

سأقوم أنا ومجموعة من الزملاء اليوم بتوضيح كيفية إجراء مقايسة تنكس الخلايا العصبية الدوبامينية في ديدان C Elegans. سأقوم بتهجين سلالة من الديدان التي تعاني من تنكس عصبي دوباميني مع سلالات معدلة وراثياً تفرط في التعبير عن جينات مرشحة مرتبطة بالمرض وفي الخلايا العصبية الدوبامينية. مرحباً، أنا آدم هارينغتون، طالب دراسات عليا في مختبر كولدويل.

سأوضح لكم اليوم كيفية إعداد الديدان المعدلة وراثياً لتحليل عصبونات الدوبامين. مرحباً، أنا شو أميتشي، وطالبة دراسات عليا. سأقوم هنا بتوضيح كيفية تحليل عصبونات الدوبامين في ديدان C elegance، والتي تسمى ceps و aides.

بشكل عام، لا تظهر الديدان التي تعبر عن GFP فقط في الخلايا العصبية الدوبامينية موتاً خلوياً. ومع ذلك، في وجود CLE، ستلاحظ حدوث ذلك وضموراً عصبياً مرتبطاً بالعمر. وباستخدام هذا المقايسة، يمكن التعبير المشترك عن جين منقول في الخلايا العصبية الدوبامينية لتحديد ما إذا كان بإمكانه تعزيز أو تثبيط السمية الناجمة عن CLE. لذا، فلنبدأ.

قبل إجراء تحليل عصبونات الدوبامين، يجب أولاً تهجين سلالات GaN المناسبة للبدء في وضع ثمانية ديدان تعبر عن كل من alphas nucle وGFP تحت تحكم محفز dat one النوعي لعصبونات الدوبامين على طبق التزاوج. الآن، أضف اثنين من ديدان ca المعدلة وراثياً في المرحلة L4، والتي تظهر تعبيراً نوعياً لعصبونات الدوبامين للجين المرشح قيد الدراسة، بالإضافة إلى تعبير خلية عضلة جدار الجسم لعلامة الاختيار الفلورية DS red two. ومن المهم ملاحظة أننا نولد ثلاثة خطوط معدلة وراثياً مستقرة لكل بنية جين دخيل.

لذا يجب إجراء هذا التهجين الجيني بشكل منفرد لكل خط من الخطوط المستقرة الثلاثة التي تم إنشاؤها. وبعد مرور يومين، قم بإزالة الذكور والتخلص منها بعد مرور يومين إلى ثلاثة أيام إضافية. ثم افحص جيل F1.

هناك عدة ذرية من الذكور وكان التزاوج ناجحاً. بعد ذلك، انقل بشكل فردي إلى أطباق جديدة خمسة من Aphrodite L four وأربعة حيوانات من كل عملية تهجين تظهر كل من العلامة الفلورية GFP الموروثة من الأب الذكر وعلامة عضلات جدار الجسم الفلورية DS red two الموروثة من الأب hamadi. يجب أن تكون الحيوانات المنقولة في مرحلة L four لضمان أنها لم تصل بعد إلى مرحلة M.

مع وجود الحيوانات الذكور على الطبق، اترك الحيوانات تتزاوج ذاتياً لمدة تتراوح بين ثلاثة إلى أربعة أيام لإنتاج نسل الجيل الثاني F two. الآن، قم بفرز نسل الجيل الثاني F two؛ وللقيام بذلك، انقل من خمسة إلى 10 حيوانات تظهر عليها كلتا العلامتين المورفولوجيتين إلى أطباق فردية خاصة بها.

بعد ذلك، يتم فحص الجيل الثالث (F3) لتحديد الأطباق التي تعبر فيها جميع الحيوانات بنسبة 100% عن GFP في العصبونات الدوبامينية، والتي يعبر بعض حيواناتها عن الواسم الفلوري DS red two في خلايا عضلات جدار الجسم. ستكون هذه الحيوانات متماثلة الزيجوت لجينات alpha synuclein وGFP، كما ستنقل الجين المنقول المُنشأ حديثاً بشكل مستقر. وبمجرد اكتمال عملية الفحص، نصبح مستعدين لإجراء تحليل العصبونات الدوبامينية.

لبدء تحليل العصبونات، قم بتجهيز أطباق حديثة للحيوانات الثلاثة التي تم تحديدها في الخطوة السابقة. خصص طبقاً لكل سلالة من السلالات المعدلة وراثياً الثلاث. بالإضافة إلى ذلك، قم بتجهيز طبق لسلالة alpha-synuclein GFP وحدها كعينة ضابطة، واترك الديدان لتنمو حتى مرحلة البلوغ.

بمجرد وصول الديدان إلى مرحلة البلوغ، يتم نقل 30 إلى 40 حيواناً معدلاً وراثياً من كل سلالة إلى طبق جديد. تُترك الديدان لوضع البيض لمدة خمس ساعات عند درجة حرارة 20 °C. بعد مرور خمس ساعات، يتم إزالة الديدان والتخلص منها.

يُترك البالغون للأجنة لتنمو لمدة تتراوح من ثلاثة إلى أربعة أيام عند 20 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة L4. بعد ذلك، يتم نقل حوالي مائة حيوان معدل وراثياً في المرحلة L4 إلى طبق يحتوي على 0.04 مليجرام/ملليلتر من 5-fluoro-2'-deoxyuridine.

يمنع هذا النظير النيوكليوتيدي تطور الجيل التالي عن طريق تثبيط تخليق DNA. وبما أن أطباق FDUR حساسة للضوء، يجب حمايتها من الضوء عن طريق إبقاء الأطباق مغطاة وملفوفة بالكامل. قم بإعداد وسادة أغار (agar pad) لتحليل الديدان.

تُستخدم هذه العينات وهي طازجة ولا يُسمح بجفافها. قم بتجهيز شريحتين مجهريتين وُضعت عليهما قطعة من الشريط اللاصق بشكل طولي؛ حيث يعمل الشريط كفاصل لضمان الحصول على وسادات متساوية السمك.

ضع شريحة ثالثة بينهما على المنضدة. لقد تم وضعهم الآن، ثلاث شرائح جنباً إلى جنب.

ضع قطرة من الشمع المنصهر في منتصف الشريحة وضع بسرعة شريحة أخرى فوقها بشكل عمودي ومتقاطع عبر الشرائح الثلاث. كرر العملية لتحضير عدة وسادات إضافية حسب العدد المطلوب للعينات المراد تحليلها. وبمجرد تجهيز وسادات الشمع، ضع قطرة بحجم 6 µL من محلول مخدر بتركيز 3 mM على غطاء زجاجي مقاس 22 × 30 mm.

انقل 40 حيواناً بالغاً إلى القطرة، ثم اقلب غطاء الشريحة فوق وسادة الأجار. كرر العملية لكل سلالة أخرى. قم بفحص 30 حيواناً من كل سلالة للتحقق من وجود كل من عصبونات CEP وعصبون D.

باستخدام مجهر مركب مزود بفلورة فوقية (epi fluorescence) في مكعب ترشيح يسمح بتصور FITC أو GFP، سنستخدم مكعب ترشيح endo G-F-P-H-Y-Q لتسجيل البيانات في ورقة رصد. تحتفظ الحيوانات من النوع البري (Wild type) بـ GFP كامل في جميع الخلايا العصبية الأربع CEP وخليتين من الخلايا العصبية A DE. يتم تصنيف الحيوانات الفردية التي تظهر فقداناً في الخلايا العصبية D على أنها نوع بري معروف أو متحللة.

تُسجَّل هذه العصبونات على أنها LG أو فقدان لبروتين GFP. وبالمثل، يمكن تقييم مدى التحلل من خلال عدّ إجمالي العصبونات المفقودة في كل حيوان، بالإضافة إلى تكرار التحليل مرتين إضافيتين، مع استخدام 30 حيواناً إضافياً لكل سلالة في كل تجربة.

يتم حساب متوسط العدد الإجمالي للديدان التي تظهر عصبونات دوبامين من النوع البري من جولات التحليل الثلاث. ثم يتم إجراء التحليل الإحصائي للحماية العصبية باستخدام اختبار T-test للطلاب، وتعتبر قيمة P أقل من 0.05 دالة إحصائياً. ولمقارنة الديدان الضابطة بالسلالات التي تفرط في تعبير الجينات المرشحة في عصبونات الدوبامين، يتم إجراء هذا التحليل في أيام مختلفة بعد وضع البيض، مع تحديد أيام التحليل المناسبة تجريبياً.

على سبيل المثال، لقد حددنا أن 77% و 87% و 90% من حيوانات alpha CLE مضافاً إليها GFP تظهر تدهوراً في العصبونات الدوبامينية في اليوم السادس والسابع والعاشر بعد النمو على التوالي. وبناءً على ذلك، إذا توقعنا أن الجين المنقول المستهدف قد يعزز التدهور العصبي، فسنقوم بالتحليل في اليوم السادس. وبالمثل، فإن الجين المنقول الذي قد يثبط التدهور العصبي سيتم تحليله في اليومين السابع والعاشر.

لقد أوضحنا لكم للتو كيفية إجراء مقايسة التنكس العصبي للدوبامين في دودة *Caenorhabditis elegans*. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ما يلي: أولاً، استخدام مؤشر مناسب للاختيار أثناء التهجينات الجينية. ثانياً، استخدام ذكور سليمة ويرقات في المرحلة L4 للتهجينات.

وثالثاً، تأكد من عدّ عصبونات CEP و DE بدقة وبشكل متسق. ستسمح لك هذه الإجراءات بإجراء تحليل سريع للعوامل الوراثية التي قد تعزز أو تثبط التنكس العصبي الناجم عن alpha alpha CLE. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.