الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

أهلاً بكم، أنا راندال هوفمان، طالب دراسات عليا في مختبر سوزان لينوس بقسم الأحياء في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT). سأقوم اليوم بتعريفكم على تقنية الفصل الكهربائي للهلام باستخدام أغاروز والمنظفات شبه المسخ، أو ما يعرف بـ SDD-AGE. يستخدم مختبرنا هذه التقنية للكشف عن البريونات والبروتينات الأخرى المكونة للتجمعات البروتينية.

إن إصدارنا من تقدير العمر بواسطة SDD بسيط وموثوق ويمكن توسيع نطاقه لاستيعاب أي عدد من العينات. وتتميز الأميلويدات بمقاومة استثنائية للمسخ بواسطة SDS، مما يسمح بفصلها عن البروتينات الأخرى باستخدام SDDH. ومع ذلك، لا يمكن استخدام البيانات المستمدة من SDDH بمفردها لتأكيد أن مادة ما هي أميلويد.

للقيام بذلك، ستحتاج إلى استخدام تقنيات أخرى. ومع وضع ذلك في الاعتبار، دعني أوضح لك. يمكن إجراء S-D-D-H-S-D-D-H باستخدام المعدات القياسية للهجرة الكهربائية الأفقية لـ DNA.

أولاً، يجب تجميع صينية صب الهلام. سيعتمد حجم الجهاز على عدد العينات المتوفرة لديك. فبالنسبة للأعداد الكبيرة من العينات، نستخدم لوحاً بمقاس 20 × 24 centimeter، وما يصل إلى أربعة أمشاط سعة 50 well.

لتحضير الهلام، ستحتاج إلى agarose منخفض الكهرومغناطيسية بصلابة متوسطة أو عالية، ومحلول منظم 1X TAE، ومحلول مخزون بتركيز 10% من SDS. قم بتحضير محلول agarose بتركيز 1.5% مع محلول 1X TAE. يُفضل جعل الهلام بسمك أكبر قدر ممكن لتمكين تحميل أكبر كمية من العينة ورفع كفاءة الكشف إلى الحد الأقصى. قم بتسخين الخليط في الميكروويف حتى يذوب agarose تماماً.

أضف سريعاً مخزون XSDS بتركيز 100X إلى 0.1% وحرّك المزيج بحركة دائرية. إذا تجمعت بعض الأجار خلال هذه الخطوة، قم بإذابتها على لوح تسخين، مع الحرص على عدم وصول المحلول إلى درجة الغليان.

بعد إضافة SDS، وبما أن المحلول سيفور بسهولة، صب هذا المحلول في صينية الصب بينما لا يزال ساخناً. ثم استخدم مشطاً للتخلص من أي فقاعات قد تتداخل لاحقاً أثناء عملية نقل الهلام. بعد أن يبرد الهلام تماماً ويتصلب، قم بإزالة الأمشاط بعناية وضع الهلام في الحوض.

اغمر الهلام تماماً في محلول XTAE بتركيز 0.1% SDS. أنت الآن مستعد لتحميل العينات. يتم تحضير عينات البروتين المستخدمة في SDDH تماماً كما في SDS page مع وجود استثناءين هامين.

أولاً، يجب تجنب تسخين العينات لأن ذلك قد يؤدي إلى تغيير طبيعة التجمعات البروتينية وتحويلها إلى مونومرات بروتينية. ثانياً، يجب الحرص على تجنب تحلل البروتين. ونظراً لأن ظروف تغيير الطبيعة المستخدمة هنا ليست كافية لتعطيل جميع البروتيازات، فإننا نوصي باستخدام ضعف التركيز الموصى به على الأقل من مزيج مثبطات البروتياز الكامل.

في هذا العرض التوضيحي، سنستخدم مستخلصات من خلايا خميرة تفرز بروتيناً معيناً مستهدفاً بشكل مفرط. نستخدم عادةً مزارع سعة 2 mL يتم تحضيرها طوال الليل في ألواح ذات 96 بئراً متوفرة من VWR، ولكن عند تحليل البروتينات ذات الوفرة المنخفضة، يجب استخدام أحجام مزارع أكبر.

قم بحصد الخلايا عن طريق طرد مركزي للمزرعة عند 2000 RCF لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وبعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي واغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في الماء وطردها مركزياً مرة أخرى. بعد الدورة الثانية، قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في محلول التغطية المناسب. يقوم الإنزيم الموجود في المحلول بهضم جدران الخلايا، مما يسمح لك بتحليل الخلايا بكفاءة باستخدام حجم صغير من محلول التحلل. يتم التحضين لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية.

قم بترسيب الخلايا البلاستيكية الاحتياطية هذه المرة عند 800 RCF لمدة خمس دقائق. أزل السائل تماماً وأعد تعليق كل راسب في 100 µL من محلول التحلل. بعد ذلك، غطِّ الكتلة بشريط لاصق واستخدم جهاز الرجي (vortex) على سرعة عالية لمدة دقيقتين.

يساعد ذلك في ترسيب جميع المواد البلاستيكية الكروية مع الحطام الخلوي عند 4,000 RCF لمدة دقيقتين. انقل السائل العلوي بعناية إلى لوحة PCR ذات 96 بئراً.

عادةً ما نقوم بتحليل مئات العينات في وقت واحد في مختبرنا، لذا نستخدم نظاماً لمناولة السوائل لمساعدتنا في ذلك. إذا لزم الأمر، يتم تحديد تركيز البروتين في المحللات. بعد ذلك، أضف محلول عازل للعينات بتركيز 4x إلى العينات للحصول على محللات تحتوي على محلول عازل بتركيز 1x، ثم يتم التحضين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم الآن بتحميل العينات في الهلام. إذا كنت ترغب في ذلك، احتفظ بنصف العينات لتحليل SDS page. قم أيضاً بتحميل علامات الوزن الجزيئي، بما في ذلك العلامات المصبوغة مسبقاً وعلامة ذات وزن جزيئي مرتفع جداً مثل مستخلص chicken flector s.

إذا رغبت في ذلك، فمن المهم الحفاظ على برودة الهلام لمنع انتشار البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض، لذا قد تود تشغيله في الغرفة الباردة. قم بتشغيل الهلام بجهد منخفض أقل من ثلاثة فولت لكل سنتيمتر من طول الهلام. قم بتشغيل الهلام لعدة ساعات حتى تصل جبهة الفصل إلى مسافة سنتيمتر واحد تقريبًا من نهاية الهلام.

نظراً لأن الأميلويد لا يتم مسخه باستخدام 2%SDS في درجة حرارة الغرفة، فإنه سيبقى سليماً بينما تتفكك المعقدات الأخرى، بما في ذلك معظم التجمعات غير الأميلويدية، في وجود 2%SDS. وبالتالي، ستكون معظم البروتينات في شكل مونومرات وتتحرك بسرعة عبر الهلام، بينما ستهاجر الأميلويدات ذات الوزن الجزيئي العالي والمقاومة لـ SDS بشكل أبطأ.

بعد ذلك، سيكون الهلام جاهزاً للنقل. وعلى الرغم من إمكانية استخدام طرق نقل متعددة، فإننا نحصل على أفضل النتائج باستخدام النقل الشعيري. وبما أن النقل الشعيري يمكن أن يستوعب أي حجم من الهلام، فمن العملي تحليل مئات العينات باستخدام هذه الطريقة.

تعمل مجموعة من أوراق الترشيح الجافة على سحب المحلول المنظم عبر الهلام، مما يؤدي إلى ترسيب البروتينات على غشاء نيتروسليلوز يوضع بين الأوراق والهلام. ستحتاج إلى قص قطعة من النيتروسليلوز، مثل high bond C، extra، بنفس أبعاد الهلام. ستحتاج أيضاً إلى قص 20 قطعة من ورق الترشيح GBO oh four وثماني قطع من ورق الترشيح GBO oh two بنفس حجم الهلام.

إن GBO 4 سميك جداً وامتصاصه عالٍ. بينما GBO 2 أرق بكثير وذو قوام أنعم، مما يضمن تلامساً أكثر تجانساً مع الغشاء. قص قطعة إضافية من GBO 4 لاستخدامها كفتيلة، واجعلها أعرض بنحو 20 سنتيمتراً من الهلام المغمور.

ضع غشاء UL WIC النيتروزي وأربع قطع من GBO oh two وقطعة واحدة من XTBS في حاوية بلاستيكية، ثم قم بتجميع مجموعة من الأوراق على النحو التالي: 20 قطعة من GBO oh four الجاف، ثم أربع قطع من GBO oh two الجاف، ثم قطعة واحدة من GBO oh two المبللة مسبقاً.

ضع غشاء النيتروسليلوز فوق هذه المجموعة. اشطف الهلام الموجود على صينية الصب لفترة وجيزة بالماء لإزالة فائض محلول التشغيل المنظم. ثم ابدأ بحذر في سحب الهلام من الصينية إلى المجموعة، مع ترطيب الغشاء بمحلول TBS حسب الضرورة أثناء سحب الهلام من الصينية.

يساعد المحلول المنظم الإضافي في منع انحباس الفقاعات داخل الهلام. وتعمل ماصة النقل بشكل جيد لهذا الغرض بعد نقل الهلام بالكامل إلى وحدة التجميع. افحص بدقة للتأكد من عدم وجود فقاعات.

ارفع حافة الهلام وأضف المنظم مرة أخرى حتى يتم التخلص من الفقاعات. ضع قطع GBO الثلاث المتبقية والمبللة مسبقاً فوق الهلام. تأكد من التلامس التام بين جميع الطبقات عن طريق تمرير الماصة بقوة فوق مجموعة الطبقات.

أحِط مجموعة النقل بصينيتين مرتفعتين تحتويان على TBS، ثم ضع الفتيلة المبللة مسبقاً فوق المجموعة، بحيث يكون طرفا الفتيلة مغمورين. قم بتغطية مجموعة النقل المجمعة بصينية بلاستيكية إضافية في TBS، مع وضع ثقل إضافي فوقها مثل زجاجة ماء سعة 500 مل. ستقوم الفتيلة بسحب المنظم من الصواني، وستعمل أوراق الترشيح الجافة على سحب المنظم عبر الهلام على مدار عدة ساعات.

سيؤدي ذلك إلى ترسيب البروتينات على الغشاء، اترك عملية النقل تستمر لمدة ثلاث ساعات على الأقل أو طوال الليل. بعد اكتمال النقل الشعيري، يمكن معالجة الغشاء عن طريق لطخة ويسترن القياسية. تظهر هنا لطخة نموذجية لبروتينات تم التعبير عنها بشكل مفرط في سلالة من الخميرة تهيئ بروتينات معينة لتكوين الأميلويد.

يمكنكم أن تروا بوضوح أن بعض المرشحين لدينا يشكلون أميلويد أو أنواعاً مقاومة لـ SDS ذات وزن جزيئي عالٍ بشكل جيد جداً، مثل تلك الموضحة هنا وهنا. ومع ذلك، فإن البعض الآخر لا يشكل تجمعات ويكون أحادياً تماماً مثل هذه وهذه. بالإضافة إلى ذلك، يمكنكم ملاحظة أن حجم بوليمرات الأميلويد يختلف باختلاف البروتين، وهو ما يمكنكم رؤيته في هذين المسارين.

لقد عرضنا لكم للتو طريقة بسيطة لتحليل التجمعات غير القابلة للذوبان ذات الوزن الجزيئي العالي، مثل الأميلويدات الخاصة بالبريونات المرشحة. نأمل أن تكونوا قد استمتعتم بمشاهدة عرضنا التوضيحي وأن تجدوا هذه التقنية مفيدة في دراسات البروتينات المناعية Amy. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في أبحاثكم.