عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

من أجل دراسة تفاعلات الحمض النووي للكروماتين التي تحكم التعبير الجيني الخاص بالعصبونات في الدماغ البشري، يجب أولاً الحصول على مجتمع نقي من النوى العصبونية لتحقيق ذلك. يتم تجنيس أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة وعزل إجمالي النوى باستخدام طرد مركزي بتدرج الكثافة. بعد ذلك، يتم وسم النوى بأجسام مضادة خاصة بالعصبونات وعزلها عبر الفرز القياسي للتدفق، وأخيراً تركيزها باستخدام الطرد المركزي الفائق.

مرحباً، أنا أنيش ماتان من مختبر الدكتورة شارون ماك باريان هنا في قسم الطب النفسي بكلية الطب في جامعة ماساتشوستس. سأعرض لكم اليوم إجراءً لعزل النوى العصبونية من أنسجة دماغ بشرية بعد الوفاة. لذا، لنبدأ.

لكل عينة نوى سيتم فرزها، ابدأ بألف مليجرام من أنسجة الدماغ المجمدة بعد الوفاة. بهذه الكمية، يمكنك الحصول على حوالي 5 مليون نواة عصبية بعد الفرز المنشط بالفلورة. لبدء استخلاص النوى، ضع 250 مليجرام من أنسجة الدماغ في أنبوب مركز طرد مركزي يحتوي على 5 mils من محلول التحلل، وضعه على الثلج.

بمجرد ذوبان النسيج، يتم طحنه لمدة دقيقة واحدة فوق الثلج. وبعد الطحن، يُنقل النسيج المتجانس إلى أنبوب طرد مركزي فائق شفاف سعة 15 مل، ثم يوضع الأنبوب فوق الثلج. تكرر عملية التجانس هذه لبقية النسيج.

بعد ذلك، قم بنقل 9 mL من محلول السكروز بعناية باستخدام الماصة إلى قاع أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق لإنشاء تدرج تركيز بحيث يكون محلول النسيج المتجانس فوق محلول السكروز. الآن، قم بوزن أنابيب الطرد المركزي الفائق للتأكد من توازنها أثناء عملية الطرد المركزي الفائق. قم بإجراء أي تعديلات على الوزن عن طريق إضافة محلول التحلل (lysis buffer) إلى الطبقة العليا. بعد وزن الأنابيب، ضعها في جهاز الطرد المركزي الفائق باستخدام دوّار SW 28، واضبط العينات على 107163.6 RCF لمدة 2.5 ساعة عند درجة حرارة 4 °C.

بمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، قم بشفط السائل الطافي بالإضافة إلى طبقة الحطام الموجودة عند تدرج التركيز. كن حذراً حتى لا تخلخل الراسب الموجود في قاع الأنبوب، والذي يحتوي على النوى. بعد ذلك، أضف 500 µL من محلول 1x PBS إلى كل راسب واتركه في الثلج لمدة 20 دقيقة.

بعد مرور 20 دقيقة، أعد تعليق الرواسب عن طريق السحب والضخ بالماصة. تسمح عملية الحضن على الثلج للرواسب بالذوبان قليلاً تلقائياً، مما يسهل عملية إعادة تعليق النوى، وبالتالي يقلل من مقدار الإجهاد الذي تتعرض له النوى. بعد ذلك، انقل المعلق والنوى إلى أنابيب طرد مركزي سعة 2 مل.

اجمع المحلول النووي من اثنين من أنابيب الطرد المركزي الفائق في كل أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم ضع العينات على الثلج مرة أخرى. والآن بعد اكتمال عملية استخلاص الحمض النووي، سأنتقل إلى خطوة الصبغ المناعي لعزل النوى العصبية عن طريق فرز الخلايا؛ حيث سيتم تحضين العينة التي تحتوي على النوى مع خليط صبغ مناعي يتكون من أجسام مضادة أولية وثانوية، بالإضافة إلى روابط حجب. لتحضير خليط الصبغ المناعي، أضف 1.2 µL من الجسم المضاد المحدد للعصبونات NeuN إلى 300 µL من 1x PBS. ثم أضف 100 µL من خليط الحجب، الذي يحتوي على 0.5% BSA و 10% مصل أغنام طبيعي في 1x PBS.

أخيراً، أضف 1 µL من الجسم المضاد الثانوي المسمى LOR 4 88. كما يجب تحضير صبغة مناعية لعينة ضابطة سالبة لمزيج الصبغ المناعي هذا، وذلك باستبعاد الجسم المضاد الأولي واستبداله بـ 1.2 µL من 1XPBS.

الآن، قم برجّ خلائط الصبغ المناعي باستخدام جهاز الرج (vortex) واتركها لتحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام أثناء فترة تحضن خلائط الصبغ. قم بتحضير عينات النواة الضابطة لعينة الضابط السالب عن طريق نقل 20 µL من النوى المعلقة إلى أنبوب سعة 2 mL يحتوي على 980 µL من 1x PBS. قم أيضاً بتحضير ضابط غير مصبوغ، يحتوي على محلول النواة و PBS فقط.

الآن، انقل 20 µL من النوى إلى أنبوب آخر وارفع الحجم مجدداً إلى 1 mL باستخدام 1X PBS. ثم ضع جميع العينات مرة أخرى على الثلج. وبذلك تكون خلطات الصبغ المناعي قد اكتملت.

أضف 401 µL من الخليط إلى العينة المناسبة للتحضين. تلقت عينة النوى الخليط الذي يحتوي على كل من new و LOR 4 88. بينما تلقت عينة الضابط السالب خليطاً يحتوي فقط على الجسم المضاد الثانوي LOR 4 88، في حين لم يتم إضافة أي صبغة مناعية إلى عينة الضابط غير المصبوغة.

بعد ذلك، انقل العينات إلى جهاز الدوران المبرد وقم بتدويرها في الظلام لمدة 45 دقيقة. والآن بعد اكتمال فترة الحضن التي استمرت 45 دقيقة، سأنقل العينات إلى مرفق التدفق الخلوي المركزي في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس لإجراء فرز مفعل بالفلورة. خلال النقل إلى المرفق المركزي، يجب الاحتفاظ بالعينات على الثلج وفي الظلام. في مرفق التدفق الخلوي المركزي، يتم أولاً ترشيح العينات عبر مرشح 40 ميكرون، ثم يتم تمريرها عبر الجهاز لبضع دقائق مع الحفاظ عليها باردة.

يتم إجراء ذلك للحصول على بعض البيانات الأولية قبل عملية الفرز. حيث تحدد عينة الضبط غير المصبوغة درجة الفلورة السلبية. وبناءً على هذه المعلومات، يتم ضبط حساسية الجهاز تجاه الفلورة.

تُستخدم العينة الضابطة المصبوغة للتحكم في الفلورة. وأي ضجيج في الخلفية ناتج عن الفلورة في هذه المرحلة، يتم بناءً عليه تعيين البوابات المناسبة المطلوبة للفرز. وتُستخدم عدة بوابات مختلفة لفرز العينات.

إليك بعض البيانات النموذجية للبوابة الأولى. يوضح مخطط تحليل fow هذا عينة ممثلة بعد ضبط البوابة. تتعرف البوابة الأولى على أنماط الحطام والنوى الحيوية بناءً على مجموعة من الإعدادات مثل الفلورة والخبرة البصرية العامة.

يمثل المحور x التشتت الأمامي، والذي يتوافق مع الحجم النسبي، بينما يمثل المحور Y التشتت الجانبي، والذي يعبر عن التعقيد الداخلي مثل الحبيبية. كما يمكن للبوابة الأولى أن تعطي فكرة عن حجم النوى المختلفة الموجودة في عينتنا. وهذا يسمح بفصل الحطام عن النوى الفعلية، وإليكم بعض البيانات النموذجية من البوابة الثانية.

يوضح مخطط الفاكس هذا مثالاً لبوابة ثانية، والتي تسمح بفرز النوى بشكل فردي مع استبعاد أي تجمعات. تعتمد هذه البوابة على الاختلافات في المدة الزمنية التي تستغرقها النوى للمرور عبر الليزر، حيث تستغرق التجمعات عادةً وقتاً أطول للمرور.

يعد هذا المعيار تحديداً هاماً جداً، حيث إن تضمين التجمعات قد يؤثر على الدقة نظراً لأن بعض النوى الفلورية قد تكون مرتبطة بنوى غير فلورية. وأخيراً، إليكم البيانات النموذجية من البوابة الثالثة؛ حيث تم ضبط هذه البوابة على طول موجي فلوري محدد يتوافق مع الفلوروفور الموجود في الجسم المضاد الثانوي لدينا.

في هذا المخطط البياني، يظهر مستوى الفلورية على طول المحور x وكاشف القناة الحمراء العميقة، PECY seven على طول المحور Y. وتوفر هذه البقع النقطية رؤية بصرية أفضل مقارنة بمخطط التكرار أحادي اللون. كما يتيح وضع SCADA فرز وفصل النوى العصبونية الجديدة والموجبة عن النوى غير العصبونية الجديدة والسالبة.

بعد اختيار جميع البوابات، يتم فرز النوى في أنبوب XPBS واحد. وبمجرد مرور العينة بأكملها عبر عملية الفرز الفعلي، يتم التحقق من نقاء الفرز عن طريق تشغيل Eloqua للعينة المفرزة عبر الجهاز. إليك مثال على نتيجة مثالية.

قارن هنا بين عينة ما قبل الفرز، التي تحتوي على مجموعة مختلطة من النوى، وعينة Eloqua المفرزة التي تم فيها التخلص من معظم النوى السلبية. لاحظ أن نسب النقاء تعتمد على عدد الأحداث التي تلوث العينة بناءً على البوابات التي تم ضبطها. ضع في اعتبارك أنه عند تمرير العينة عبر الجهاز للمرة الأولى، قد يحدث بعض البهتان، مما يؤدي إلى ضعف في السطوع؛ ولتعويض ذلك، قد يلزم إجراء بعض التعديلات.

بمجرد فرز العينة، ابدأ في معالجة النوى. وللقيام بذلك، خذ 10 mils من العينة المفرزة وأضف مليلترين من محلول السكروز، و50 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 1 M، و30 µL من خلات المغنيسيوم بتركيز 1 M. إذا كان حجم العينة المفرزة أقل من 10 mils، ارفع الحجم إلى 10 mils بإضافة 1XPBS أو اضبط كميات المواد المضافة وفقاً لذلك.

بعد ذلك، اقلب العينة عدة مرات وضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة. وبعد مرور 15 دقيقة، قم بطرد العينة مركزياً في دوار ذي دلاء متأرجح بسرعة 1,786 RCF لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد عملية الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي بعناية دون تحريك الراسب الأبيض الموجود في قاع الأنبوب.

ثم قم بإذابة الراسب في 200 µL من المحلول المناسب المطلوب للتجارب السابقة. في هذه الحالة، نقوم بإذابة الراسب في محلول التخفيف (downing buffer) من أجل تجربة الرقاقة اللاحقة. بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الراسب عن طريق السحب والضخ بالمصّة.

في هذه المرحلة، يمكنك نقل النوى إلى أنبوب أصغر ووضعه في مجمد درجة حرارته 80- درجة مئوية. حتى يحين موعد استخدامها لاحقاً، حسناً، لقد شرحت لك للتو كيفية عزل النوى العصبية من أنسجة دماغ بشرية بعد الوفاة. وباستخدام هذه النوى، يمكنك إجراء عدد من التحليلات المختلفة مثل الترسيب المناعي للكروماتين.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الاحتفاظ بالعينات دائمًا على الثلج لأن النوى غير مثبتة ويمكن أن تتحلل في درجات الحرارة المرتفعة. كما أنه من المهم التعامل مع الأنسجة البشرية وفقًا لمعايير السلامة في المستوى الثاني من السلامة البيولوجية أو أعلى. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.