انتقائية وسمها بروتينات سطح الخلية باستخدام CyDye DIGE ملونات فلور الحد الأدنى

اسمي ماريا وأعمل في Y Healthcare في NOS بالسويد. غالبًا ما تشارك بروتينات سطح الخلية في التواصل بين الخلايا وبيئتها، ولذلك فهي تحظى باهتمام خاص في الأبحاث التي تهدف إلى اكتساب رؤى أعمق حول الأمراض، بالإضافة إلى التغيرات البيولوجية الأخرى الناتجة عن التغيرات في بيئة الخلية. سأعرض لكم في هذا الفيديو بروتوكولاً بسيطاً لوسم سطح الخلية بطريقة side-eye dodge، حيث ستتمكنون من إثراء هذه البروتينات منخفضة الوفرة بصرياً دون تعزيز مادي، ودراسة الاختلافات في بروتينات سطح الخلية هذه باستخدام هذه التقنية.

إذا وجدت هذه التقنية مثيرة للاهتمام، يمكنك العثور على مزيد من المعلومات في دليل الـ 2D. علاوة على ذلك، لدينا مذكرة تطبيقية حول هذا الموضوع تحديداً يمكنك تحميلها من job. في بروتوكول وسم سطح الخلية الموضح في الأعلى، يتم وسم الخلايا بينما لا تزال سليمة. وخلال عملية الوسم، لن يتمكن الصبغ من الوصول إلا إلى بروتينات سطح الخلية.

بعد خطوة الوسم، يتم تحليل الخلايا للتحقق من دقة الوسم الخاص بسطح الخلية. تم تجزئة عينة الوسم إلى بروتينات غشائية وبروتينات سيتوزولية، كما تم تحضير عينة غير مجزأة بالتوازي.

للمقارنة، لا يُعد تحليل التجزئة هذا ضرورياً، ولكن تم إجراؤه هنا فقط لإظهار أن بروتوكول سطح الخلية محدد للبروتينات الموجودة على سطح الخلية. كما قمنا بإجراء بروتوكول وسم ETH القياسي غير الغذائي الموضح أدناه، حيث يتم تحلل الخلايا قبل الوسم، وبهذه الطريقة تصبح جميع البروتينات الخلوية متاحة للوسم. وبعد خطوة الوسم، تخضع العينات للفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد (2D electrophoresis).

يتم فصل الخلايا الملتصقة باستخدام إجراء غير إنزيمي لتجنب هضم بروتينات سطح الخلية المستهدفة. نستخدم في هذا البروتوكول الممسحة المطاطية (rubber policeman)، ولكن يظل استخدام وسط تفكيك الخلايا الإنزيمي خياراً متاحاً؛ يتم عدّ معلقات الخلايا وتقسيمها إلى حصص تتراوح من 5 إلى 10 ملايين خلية لكل أنبوب. بعد ذلك، يتم تجميع الخلايا بالترسيب وغسلها في H-P-S-S-P-H 7.4 لإزالة آثار مستنبت الخلايا.

يمكن أن يتداخل تلوث الوسط البروتيني من بروتينات المصل والمكونات الفلورية مع عملية الوسم والكشف. يتم تجميع الخلايا النامية في معلق بشكل مباشر في كريات وغسلها قبل خطوة الوسم التي تلي عملية الغسل. ثم يتم إعادة تعليق كريات الخلايا في 200 µL من محلول الوسم المبرد بالثلج والذي يحتوي على HPSS بـ pH 8.5 و urea بتركيز one molar.

لضمان ظروف وسم مثالية لبروتينات سطح الخلية، يجب دائماً التحقق من قيمة pH. قبل عملية الوسم، استخدمنا 600 pic mold من side-eye لـ 10 مليون من خلايا CHO. ستختلف النسبة المثالية من side-eye إلى عدد الخلايا اعتماداً على نوع الخلية.

نظراً لأننا لا نعرف التركيزات الدقيقة للبروتينات على سطح الخلية، فإن كيفية تحديد الظروف المثلى لوسم البروتينات بتقنية side-eye موصوفة في كتيب مبادئ وطرق الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد. يتم تحضين الخلايا مع side eye D floor، minimal dice لمدة 20 دقيقة على الثلج في الظلام.

بعد تفاعل الوسم، يتم إخماد الصبغة غير المتفاعلة بإضافة 20 µL من الليسين بتركيز 10 mM. تُغسل الخلايا الموُسمة الآن مرتين في محلول HPSS المنظم البارد عند pH 7.4 لإزالة الصبغة الزائدة. وبذلك، لن تبقى أي صبغة حرة تسبب وسماً غير مرغوب فيه داخل الخلايا أو للبروتينات في الخطوة التالية، وهي تحلل الخلايا.

تم الآن وسم البروتينات الموجودة على سطح الخلية، وغسل الخلايا وأصبحت جاهزة للتحلل. يتم إعادة تعليق الراسب الناتج عن خطوة الغسل الأخيرة في 150 µL من محلول التحلل البارد الذي يحتوي على 7 M uria و 2 M thi uria و 4% chaps و 30 mM trees و 5 mM magnesium acetate بـ pH 8.5، ويُترك على الثلج لمدة ساعة واحدة على الأقل مع الرج المتقطع باستخدام جهاز vortex. العينات الآن جاهزة للفصل ثنائي الأبعاد (2D separation).

تتمثل الخطوة الأولى في عملية الرحلان الكهربائي في تحضير شرائط IPD لإعادة الترطيب. قم بتحضير محلول إعادة الترطيب المخصص عن طريق إضافة منظم IPG buffer المتوافق مع نطاق pH للشرائط المستخدمة، ثم أضف المحلول في تجويف صينية إعادة الترطيب. قم بإزالة الغشاء الواقي من شريط IPG وضع الشرائط بعناية بحيث يكون الجل الجاف مواجهاً للأسفل في صينية إعادة الترطيب التي تحتوي على محلول إعادة الترطيب.

أغلق غطاء صندوق IPG واترك الشرائط لترطب طوال الليل. في البعد الأول، وهو التركيز المتساوي الكهربائي، يتم فصل البروتينات وفقاً لنقطة التعادل الكهربائي (pi) الخاصة بها. يتم تنفيذ ذلك باستخدام IPG four three.

توضع الشرائط المعاد ترطيبها في الموزع ويُثبت القطب الكهربائي في الأعلى. تم وضع 50 micrograms من كل عينة باستخدام أغطية تطبيق العينات. لقد قمنا إما بتطبيق العينات غير المجزأة مباشرة دون تجزئة مسبقة، أو جزأنا العينات إلى أجزاء غشائية وسيتوسولية قبل تطبيقها.

يتم إغلاق الغطاء لحماية العينات الفلورية من الضوء. تمت برمجة الجهاز وفقاً للتوصيات وتشغيله طوال الليل. تم تشغيل هلامات lamby كبيرة بنسبة 12% باستخدام هلام 12 للبالغين.

أُضيف محلول إزاحة كوستر (Coster displacing solution) لتجنب بلمرة هلامات الأكريلاميد داخل الأنابيب. تُرِكت الهلامات لتتبلمر طوال الليل في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. بعد عملية التركيز المتساوي الكهربائي، تُزال الشرائط وتُوازن في محلول منظم يحتوي على SDS على خطوتين؛ باستخدام DTT لاختزال روابط ثنائي الكبريتيد في بقايا السيستين، يليه إجراء عملية ألكلة باستخدام أسيتاميد اليوريك لتجنب التعديل بواسطة الأكريلاميد.

تُغمر شرائط IPG في محلول التشغيل (running buffer) ثم تُوضع بعناية فوق هلامات two dig الكبيرة. يتم تجنب حبس الهواء بين الشرائط والهلام عن طريق إضافة محلول agro بنسبة 2% مصهور مع صبغة bromo anol blue في الأعلى. تصبح الهلامات الآن جاهزة لعملية الفصل بالكهرباء الهلامية بوجود SDS في البعد الثاني. في الفصل بـ SDS page في البعد الثاني.

سيتم فصل البروتينات وفقاً للوزن الجزيئي باستخدام نظام tonal six. املأ غرفة الفصل الكهربائي بمحلول التشغيل المصعدي (anodic running buffer)، ثم أدخل الهلامات واملأ الحجرة العلوية بمحلول التشغيل المهبطي (cathodic running buffer). اضبط وحدة إمداد الطاقة وفقاً للتوصيات، وقم بتشغيل البعد الثاني في مكان محمي من الضوء لمدة تتراوح بين أربع إلى خمس ساعات تقريباً أو حتى تصل جبهة الصبغة إلى أسفل الهلام.

بعد الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد، توضع كاسيتات الهلام باستخدام الملاقط في جهاز التصوير الفلوري typhoon. يمكن مسح هلامين وثلاث قنوات في وقت واحد. تظهر نتيجة هذا الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد (two DL) دقة عالية في فصل بروتينات الغشاء الموجودة في العينة، على الرغم من وجود بعض القيود المعروفة في الكشف عن البروتينات الكارهة للماء في الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد (two DL). وتظهر النتائج العديد من بقع وسم سطح الخلية الجديدة الموضحة هنا باللون الأحمر، والتي لم يتم الكشف عنها باستخدام بروتوكول الوسم القياسي الموضح هنا باللون الأخضر.

تظهر هذه النتائج أن بروتوكول وسم سطح الخلية يتميز بنوعية عالية في وسم بروتينات سطح الخلية. وبما أن بروتينات سطح الخلية يتم وسمها بشكل حصري، فإن تصويرها يصبح أكثر سهولة، كما يتم تجنب التوهين الناتج عن البروتينات السيتوبلازمية الوفيرة. وتظهر في الأعلى الصورة الفلورية للهلامات التي تحتوي على جزء غشائي غير مجزأ أو جزء سيتوبلازمي.

يظهر أدناه صورة لنفس الهلام بعد صبغه بالفضة. وتوضح النتائج عدم وجود وسم فلوري للبروتينات السيتوزولية، إلا أن الصبغ بالفضة يُظهر وجود بروتينات في الهلامات. كما تُظهر النتائج أنماطاً متشابهة من خرائط البقع في كل من العينات غير المجزأة وأجزاء الغشاء، مما يثبت عدم الحاجة إلى التجزئة قبل إجراء الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد، وهو ما يجعل هذا البروتوكول بسيطاً ومريحاً في آن واحد.

تُظهر كل من SI two وSI three وSCI five أنماط وسم متشابهة، وتتوافق جميعها مع بروتوكول سطح الخلية. أُجريت تجربة غذائية باستخدام جميع أنواع side eye DI floor minimal dy الثلاثة لدراسة التعبير التفاضلي لبروتينات سطح الخلية في خلايا CHO التي تعرضت لتجويع من المصل لفترات زمنية مختلفة. تم تجميع عينات سطح الخلية CY two من جميع العينات في التجربة واستُخدمت كمعيار داخلي.

يمكن تتبع التغيرات التفاضلية لعدة بروتينات على سطح الخلية خلال فترة التجويع. وقد تم الكشف عن أكثر من 18 بروتيناً غشائياً جديداً باستخدام بروتوكول سطح الخلية، والتي لم يتم الكشف عنها باستخدام البروتوكول القياسي لتحديد هوية البروتينات في الهلام التحضيري. وكان من الضروري إجراء عملية التدعيم (spike) لعينة سطح الخلية لتسهيل المطابقة العكسية مع البقع الموجودة في مجموعة البيانات التحليلية.

إليك النتائج. تُظهر النتائج دقة عالية لعدد كبير من بروتينات سطح الخلية. يتميز هذا البروتوكول بخصوصية عالية لبروتينات سطح الخلية، ولم يُلاحظ أي وسم للبروتينات الموجودة داخل الخلايا.

باستخدام هذه الطريقة، ستتمكن من الكشف عن المزيد من بروتينات سطح الخلية مقارنة بالبروتوكول القياسي، وكما رأيت بالفعل، فإن هذا البروتوكول بسيط للغاية في التنفيذ. ما عليك سوى وسم بروتينات سطح الخلية بينما لا تزال سليمة، ثم تشغيلها مباشرة في الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد 2D electrophoresis دون الحاجة إلى تجزيء الغشاء. لذا، يعد هذا بروتوكولاً فعالاً جداً لدراسة بروتينات سطح الخلية والاختلافات بينها باستخدام تقنية D.