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Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

The tomato (Solanum lycopersicum) protein kinase Pto confers resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato bacteria expressing the AvrPto and AvrPtoB effector proteins. Pto specifically recognizes both effectors by direct physical interactions triggering activation of immune responses. Here, we used a chemical-genetic approach to sensitize Pto to analogs of PP1, an ATP-competitive small molecule inhibitor. By using PP1 analogs in combination with the sensitized Pto (Pto(as)), we examined the role of Pto kinase activity in effector recognition and signal transduction. Strikingly, while PP1 analogs efficiently inhibited kinase activity of Pto(as) in vitro, they enhanced interactions of Pto(as) with AvrPto and AvrPtoB in a yeast two-hybrid system. In addition, in the presence of PP1 analogs, Pto(as) bypassed mutations either at an autophosphorylation site critical for the Pto-AvrPto interaction or at catalytically essential residues and interacted with both effectors. Moreover, in the presence of the PP1 analog 3MB-PP1, a kinase-deficient form of Pto(as) triggered an AvrPto-dependent hypersensitive response in planta. These findings suggest that, rather than phosphorylation per se, a conformational change likely triggered by autophosphorylation in Pto and mimicked by ligand binding in Pto(as) is a prerequisite for recognition of bacterial effectors. Following recognition, kinase activity appears to be dispensable for Pto signaling in planta. The chemical-genetic strategy applied here to develop specific small molecule inhibitors of Pto represents an invaluable tool for the study of biological functions of other plant protein kinases in vivo.

Bypassing kinase activity of the tomato Pto resistance protein with small molecule ligands.

Die Tomate (Solanum Lycopersicum)-Proteinkinase Pto verleiht Resistenz gegen Pseudomonas Syringae pv. Tomaten-Bakterien der Effektor-Proteine AvrPto und AvrPtoB zum Ausdruck zu bringen. Pto erkennt beide Effektoren insbesondere durch direkten physischen Interaktionen, die Aktivierung der Immunantwort ausl&ouml;sen. Hier haben wir einen Chemikalien-genetischen Ansatz verwendet, Pto zu Entsprechungen PP1, ein ATP-kompetitiver niedermolekularer Inhibitor zu sensibilisieren. Mithilfe von PP1-Analoga in Kombination mit der sensibilisierten Zapfwelle (Pto(as)), wir untersucht die Rolle der Pto-Kinase-Aktivit&auml;t in Effektor-Anerkennung und Signal-Transduktion. Auff&auml;llig ist, w&auml;hrend PP1-Analoga effizient Pto(as) in-vitro-Aktivit&auml;t gehemmt, verbessert sie Wechselwirkungen von Pto(as) mit AvrPto und AvrPtoB in einem Hefe-zwei-Hybrid-System. Dar&uuml;ber hinaus in Anwesenheit PP1-Analoga, Pto(as) Mutationen eine Autophosphorylierung Site kritisch f&uuml;r die Pto-AvrPto-Interaktion oder auf katalytisch wesentliche R&uuml;ckst&auml;nde umgangen und interagierte mit beiden Effektoren. Dar&uuml;ber hinaus ausgel&ouml;st eine Kinase-Mangel-Form des Pto(as) in Anwesenheit der PP1 analog 3 MB-PP1, eine AvrPto-abh&auml;ngige &uuml;berempfindlichen Reaktion in Planta. Diese Forschungsergebnisse legen nahe, dass, anstatt Phosphorylierung per Se eine Konformations&auml;nderungen &Auml;nderung wahrscheinlich ausgel&ouml;st durch Autophosphorylierung in Pto und nachgeahmt von Ligand-Bindung in Pto(as) ist eine Voraussetzung f&uuml;r die Anerkennung der bakteriellen Effektoren. Nach Anerkennung scheint Kinaseaktivit&auml;t f&uuml;r Pto signalisieren in Planta entbehrlich. Die Chemikalie-genetische Strategie, die hier angewandt werden, um spezifische niedermolekularer Hemmer der Zapfwelle zu entwickeln stellt ein wertvolles Instrument f&uuml;r die Erforschung der biologischen Funktionen von anderen Pflanzen Proteinkinasen in-vivo.

Umgehen die Tomate Pto-Resistenz-Protein mit niedermolekularen Liganden-Aktivit&auml;t.

Plant genomes encode hundreds of protein kinases, yet only for a small fraction of them precise functions and phosphorylation targets have been identified. Recently, we applied a chemical-genetic approach to sensitize the tomato serine/threonine kinase Pto to analogs of PP1, an ATP-competitive and cell-permeable small-molecule inhibitor. The Pto kinase confers resistance to Pst bacteria by activating immune responses upon specific recognition of bacterial effectors. By using PP1 analogs in combination with the analog-sensitive Pto, we shed new light on the role of Pto kinase activity in effector recognition and signal transduction. Here we broaden the use of this chemical-genetic approach to another defense-related plant protein kinase, the MAP kinase LeMPK3. In addition, we show that analog-sensitive but not wild-type kinases are able to use unnatural N(6)-modified ATP analogs as phosphodonors that can be exploited for tagging direct phosphorylation targets of the kinase of interest. Thus, sensitization of kinases to analogs of the small-molecule inhibitor PP1 and ATP can be an effective tool for the discovery of cellular functions and phosphorylation substrates of plant protein kinases.

A chemical-genetic approach for functional analysis of plant protein kinases.

Pflanze Genome codieren Hunderte von Proteinkinasen, aber nur f&uuml;r einen Bruchteil von ihnen pr&auml;zise Funktionen und Phosphorylierung Ziele identifiziert wurden. Vor kurzem angewendet wir einen chemischen-genetischen Ansatz um das Tomate Serin/Threonin Kinase Pto zu Entsprechungen PP1, ein ATP-wettbewerbsf&auml;hig und Zelle-durchl&auml;ssigen klein-Molek&uuml;l-Hemmer zu sensibilisieren. Das Pto-Kinase verleiht Resistenz gegen Pst Bakterien durch die Aktivierung von Immunantworten auf spezifische Anerkennung der bakteriellen Effektoren. Mit PP1-Analoga in Kombination mit der Analog-Sensitive-Zapfwelle, werfen wir ein neues Licht auf die Rolle der Pto-Kinase-Aktivit&auml;t in Effektor-Anerkennung und Signal-Transduktion. Hier erweitern wir die Verwendung von dieser Chemikalie-genetischer Ansatz f&uuml;r eine weitere Verteidigung-&auml;hnliche Pflanze Proteinkinase, die MAP-Kinase LeMPK3. Dar&uuml;ber hinaus zeigen wir, dass Analog-Sensitive aber nicht Wildtyp-Kinasen sind unnat&uuml;rlich N (6) nutzen-ge&auml;ndert ATP Entsprechungen als Phosphodonors, die f&uuml;r direkte Phosphorylierung Ziele der Kinase des Interesses tagging genutzt werden k&ouml;nnen. So Sensibilisierung der Kinasen zu Entsprechungen der klein-Molek&uuml;l-Inhibitor PP1 und ATP kann ein wirksames Instrument f&uuml;r die Entdeckung der Zellfunktionen und Phosphorylierung Substrate Pflanze Proteinkinasen werden.

Ein Chemie-genetische Ansatz f&uuml;r funktionale Analyse der Pflanze Proteinkinasen.

The endoplasmic reticulum (ER)-associated protein degradation (ERAD) pathway eliminates aberrant proteins from the ER. The key role of Cdc48p-Ufd1p-Npl4p is indicated by impaired ERAD in Saccharomyces cerevisiae with mutations in any of this complex's genes. We identified SSZ1 in genetic screens for cdc48-10 suppressors and show that it upregulates Cdc48p via the pleiotropic drug resistance (PDR) network. A pSSZ1 plasmid restored impaired ERAD-M of 6myc-Hmg2 in cdc48-10, ufd1-2, and npl4-1, while SSZ1 deletion had no effect. Ssz1p activates Pdr1p, the PDR master regulator. Indeed, plasmids of PDR1 or its target gene RPN4 increased cdc48-10p levels and restored ERAD-M in cdc48-10. Rpn4p regulates transcription of proteasome subunits and CDC48, thus RPN4 deletion abolished ERAD. However, the diminished proteasome level in Deltarpn4 was sufficient for degrading a cytosolic substrate, whereas the impaired ERAD-M was the result of diminished Cdc48p and was restored by expression of pCDC48. The corrected ERAD-M in the hypomorphic strains of the Cdc48 partners ufd1-2 and npl4-1 by the pCDC48 plasmid, and in cdc48-10 cells by the pcdc48-10 plasmid, combined with the finding that neither pSSZ1 nor pcdc48-10 restored ERAD-L of CPY*-HA, support our conclusion that Ssz1p suppressing effects is brought about by upregulating Cdc48p.

Ssz1 restores endoplasmic reticulum-associated protein degradation in cells expressing defective cdc48-ufd1-npl4 complex by upregulating cdc48.

Dem Endoplasmatischen Retikulum (ER)-assoziierten Protein Degradation (ERAD) Stoffwechselweg eliminiert aberrante Proteine aus dem ER. Die Schl&uuml;sselrolle der Cdc48p-Ufd1p-Npl4p ist gekennzeichnet durch gest&ouml;rte ERAD in Saccharomyces Cerevisiae mit Mutationen in einem dieses Komplexes der Gene. Wir SSZ1 in genetische Schirme f&uuml;r cdc48-10 Unterdr&uuml;cker identifiziert und zeigen, da&szlig; es Upregulates Cdc48p &uuml;ber das pleiotropen Droge-Widerstand (PDR)-Netz. Ein pSSZ1-Plasmid wiederhergestellt beeintr&auml;chtigt ERAD-M 6myc-Hmg2 in cdc48-10, ufd1-2 und npl4-1, w&auml;hrend SSZ1 L&ouml;schung keine Auswirkungen hatte. Ssz1p wird Pdr1p, der PDR-master-Regler aktiviert. In der Tat Plasmide PDR1 oder sein Ziel-gen RPN4 h&ouml;here cdc48 - 10P und restauriert ERAD-M cdc48-10. Rpn4p regelt die Transkription des Proteasom-Untereinheiten und CDC48, so RPN4 L&ouml;schung ERAD abgeschafft. Allerdings war die verminderte Proteasom-Ebene in Deltarpn4 ausreichend f&uuml;r ein cytosolisches Substrat, erniedrigend, w&auml;hrend das gest&ouml;rte ERAD-M das Ergebnis einer verminderten Cdc48p war und durch Ausdruck des pCDC48 restauriert. Die korrigierte ERAD-M in die hypomorphen St&auml;mme der Cdc48 Partner ufd1-2 und npl4-1 durch die pCDC48-Plasmid und cdc48-10 Zellen durch die pcdc48-10-Plasmid, kombiniert mit der Feststellung, dass weder pSSZ1 noch pcdc48-10 ERAD-L der KPJ * wiederhergestellt-HA, unterst&uuml;tzen unsere Schlussfolgerung, die Ssz1p keinesfalls unterdr&uuml;cken Effekte durch Heraufregulierung Cdc48p herbeigef&uuml;hrt wird.

Ssz1 stellt Endoplasmatisches Reticulum-assoziierten Proteinabbau in Zellen, die defekte cdc48-ufd1-npl4-Komplex durch Heraufregulierung cdc48 zum Ausdruck.

The gram-negative bacterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria is the causal agent of spot disease in tomato and pepper. X. campestris pv. vesicatoria pathogenicity depends on a type III secretion system delivering effector proteins into the host cells. We hypothesized that some X. campestris pv. vesicatoria effectors target conserved eukaryotic cellular processes and examined phenotypes induced by their expression in yeast. Out of 21 effectors tested, 14 inhibited yeast growth in normal or stress conditions. Viability assay revealed that XopB and XopF2 attenuated cell proliferation, while AvrRxo1, XopX, and XopE1 were cytotoxic. Inspection of morphological features and DNA content of yeast cells indicated that cytotoxicity caused by XopX and AvrRxo1 was associated with cell-cycle arrest at G0/1. Interestingly, XopB, XopE1, XopF2, XopX, and AvrRxo1 that inhibited growth in yeast also caused phenotypes, such as chlorosis and cell death, when expressed in either host or nonhost plants. Finally, the ability of several effectors to cause phenotypes in yeast and plants was dependent on their putative catalytic residues or localization motifs. This study supports the use of yeast as a heterologous system for functional analysis of X. campestris pv. vesicatoria type III effectors, and sets the stage for identification of their eukaryotic molecular targets and modes of action.

Expression of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria type III effectors in yeast affects cell growth and viability.

Das Gramnegative Bakterium Xanthomonas Campestris pv. Vesicatoria ist Erreger vor Ort Krankheit in Tomaten und Pfeffer. X. Campestris pv. Vesicatoria Pathogenit&auml;t h&auml;ngt eine Typ-III-Sekretionssystem Bereitstellung Effektor Proteine in Wirtszellen. Wir die Hypothese auf, dass einige X. Campestris pv. Vesicatoria Effektoren vorbei konserviert eukaryotischen zellul&auml;re Prozesse und untersucht Ph&auml;notypen induziert durch ihren Ausdruck in der Hefe. Aus 21 Effektoren getestet hemmte 14 Hefe Wachstum in normaler oder hoher Belastung. Entwicklungsf&auml;higkeit-Probe ergab, dass XopB und XopF2 abgeschw&auml;chte Zelle Verbreitung, w&auml;hrend AvrRxo1, XopX und XopE1 zytotoxischen waren. Inspektion von morphologischen Merkmalen und DNA-Gehalt von Hefezellen erkl&auml;rt, dass die Zytotoxizit&auml;t, die aufgrund von XopX und AvrRxo1 mit Zellzyklus Verhaftung bei G0/1 verbunden war. Interessanterweise verursachte XopB, XopE1, XopF2, XopX und AvrRxo1, das Wachstum der Hefe gehemmt auch Ph&auml;notypen, wie Chlorose und Zelle Tod, als entweder Host oder Nonhost Pflanzen ausgedr&uuml;ckt. Schlie&szlig;lich war die F&auml;higkeit von mehreren Effektoren, Ph&auml;notypen in Hefe und Pflanzen ihre vermeintliche katalytische R&uuml;ckst&auml;nde oder Lokalisierung Motiven abh&auml;ngig. Diese Studie unterst&uuml;tzt die Verwendung von Hefe als heterologe System f&uuml;r Funktionsanalyse von X. Campestris pv. Vesicatoria III Effektoren geben, und die B&uuml;hne zur Identifizierung ihrer eukaryotischen Molekulare Ziele und Wirkungsweisen.

Ausdruck von Xanthomonas Campestris pv. Vesicatoria Typ III Effektoren in Hefe wirkt sich Zelle Wachstum und Rentabilit&auml;t.

The highly conserved nature of the protein kinase catalytic domain and the low permeability of plant cell membranes pose a challenge to the development of specific inhibitors that target individual protein kinases in vivo. Here, we describe a chemical-genetic approach to specifically sensitize individual plant kinases to cell-permeable small molecules that do not inhibit wild-type kinases. In this approach, a single amino-acid substitution is introduced in the ATP-binding site of the enzyme enabling specific binding of ATP-competitive molecules. Cell-permeable molecules can then be used to specifically target the sensitized allele in transgenic Arabidopsis thaliana plants that do not express the wild-type form of the kinase. This strategy provides a useful tool for the functional characterization of protein kinases in planta and for the dissection of the signaling pathways in which they are involved.

Sensitizing plant protein kinases to specific inhibition by ATP-competitive molecules.

Die stark konservierten Natur der katalytischen Protein-Kinase-Dom&auml;ne und die geringe Durchl&auml;ssigkeit der Zellmembranen Pflanzen stellen eine Herausforderung f&uuml;r die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die einzelne Proteinkinasen in-vivo Ziel. Hier beschreiben wir einen Chemikalien-genetischen Ansatz um speziell Einzelpflanze Kinasen zu Zelle-durchl&auml;ssigen kleine Molek&uuml;le zu sensibilisieren, die nicht Wildtyp Kinasen hemmen. Bei diesem Ansatz wird eine einzelne Aminos&auml;ure-Substitution in der ATP-Bindungsstelle des Enzyms aktivieren spezifische Bindung von Molek&uuml;len ATP-Wettbewerb eingef&uuml;hrt. Zelle-durchl&auml;ssigen Molek&uuml;le k&ouml;nnen dann verwendet werden, um gezielt gegen die sensibilisierten Allel in transgenen Arabidopsis Thaliana Pflanzen, die nicht die Kinase Wildtyp Form zum Ausdruck bringen. Diese Strategie stellt ein n&uuml;tzliches Werkzeug f&uuml;r die Funktionelle Charakterisierung der Proteinkinasen in Planta und die Pr&auml;paration der die Signalwege, an denen sie beteiligt sind.

Sensibilisierende Pflanze Proteinkinasen zur spezifischen Hemmung von Molek&uuml;len ATP-Wettbewerb.

Bacterial effector proteins, which are delivered into the host cell via the type III secretion system, play a key role in the pathogenicity of gram-negative bacteria by modulating various host cellular processes to the benefit of the pathogen. To identify cellular processes targeted by bacterial effectors, we developed a simple strategy that uses an array of yeast deletion strains fitted into a single 96-well plate. The array is unique in that it was optimized computationally such that despite the small number of deletion strains, it covers the majority of genes in the yeast synthetic lethal interaction network. The deletion strains in the array are screened for hypersensitivity to the expression of a bacterial effector of interest. The hypersensitive deletion strains are then analyzed for their synthetic lethal interactions to identify potential targets of the bacterial effector. We describe the identification, using this approach, of a cellular process targeted by the Xanthomonas campestris type III effector XopE2. Interestingly, we discover that XopE2 affects the yeast cell wall and the endoplasmic reticulum stress response. More generally, the use of a single 96-well plate makes the screening process accessible to any laboratory and facilitates the analysis of a large number of bacterial effectors in a short period of time. It therefore provides a promising platform for studying the functions and cellular targets of bacterial effectors and other virulence proteins.

A simple yeast-based strategy to identify host cellular processes targeted by bacterial effector proteins.

Bakterielle Effektor Proteine, die in der Wirtszelle &uuml;ber die Typ-III-Sekretionssystem geliefert werden, spielen eine Schl&uuml;sselrolle in der Pathogenit&auml;t von Gram-negativen Bakterien durch Modulation der verschiedenen Host zellul&auml;re Prozesse zum Vorteil des Erregers. Ermittlung der zellul&auml;re Prozesse gezielt durch bakterielle Effektoren, entwickelten wir eine einfache Strategie, die ein Array von L&ouml;schung Hefest&auml;mme passte in einer einzigen 96-Well-Platte verwendet. Das Array ist einzigartig, da es rechnerisch optimiert wurde, so dass trotz der geringen Zahl der L&ouml;schung-St&auml;mme, die Mehrzahl der Gene in der Hefe-synthetische t&ouml;dliche Interaktion-Netzwerk deckt. Die L&ouml;schung-St&auml;mme im Array werden f&uuml;r &Uuml;berempfindlichkeit auf den Ausdruck einer bakteriellen Effektor von Interesse gezeigt. Die &uuml;berempfindlich L&ouml;schung-St&auml;mme werden dann f&uuml;r ihre synthetischen t&ouml;dlichen Wechselwirkungen identifizieren potentielle Ziele der bakteriellen Effektor analysiert. Wir beschreiben die Identifikation mit diesem Ansatz, eines zellularen Prozesses gezielt durch die Xanthomonas Campestris Typ III-Effektor XopE2. Interessant ist, entdecken wir, dass XopE2 die Hefe-Zellwand und die Stressantwort Endoplasmatisches Reticulum betrifft. Generell ist die Verwendung einer einzigen 96-Well-Platte der Screening-Verfahren f&uuml;r alle Laboratorien zug&auml;nglich macht und erleichtert die Analyse einer Vielzahl von bakteriellen Effektoren in kurzer Zeit. Es bietet daher eine vielversprechende Plattform f&uuml;r das Studium der Funktionen und zellulare Ziele bakterielle Effektoren und andere Virulenz-Proteine.

Article	Year
Bypassing kinase activity of the tomato Pto resistance protein with small molecule ligands. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 19332544	2009
A chemical-genetic approach for functional analysis of plant protein kinases. Plant signaling & behavior\| PubMed ID: 19820342	2009
Ssz1 restores endoplasmic reticulum-associated protein degradation in cells expressing defective cdc48-ufd1-npl4 complex by upregulating cdc48. Genetics\| PubMed ID: 20038635	2010
Expression of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria type III effectors in yeast affects cell growth and viability. Molecular plant-microbe interactions : MPMI\| PubMed ID: 21062109	2011
Sensitizing plant protein kinases to specific inhibition by ATP-competitive molecules. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 21837567	2011
A simple yeast-based strategy to identify host cellular processes targeted by bacterial effector proteins. PloS one\| PubMed ID: 22110728	2011

Dor Salomon

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