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PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

RNA transcripts are subject to posttranscriptional gene regulation involving hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) expressed in a cell-type dependent fashion. We developed a cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs. The crosslinked sites are revealed by thymidine to cytidine transitions in the cDNAs prepared from immunopurified RNPs of 4-thiouridine-treated cells. We determined the binding sites and regulatory consequences for several intensely studied RBPs and miRNPs, including PUM2, QKI, IGF2BP1-3, AGO/EIF2C1-4 and TNRC6A-C. Our study revealed that these factors bind thousands of sites containing defined sequence motifs and have distinct preferences for exonic versus intronic or coding versus untranslated transcript regions. The precise mapping of binding sites across the transcriptome will be critical to the interpretation of the rapidly emerging data on genetic variation between individuals and how these variations contribute to complex genetic diseases.

Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.

RNA-Transkripte unterliegen Posttranscriptionale Genregulation bei denen hunderte von RNA-bindende Proteine (RBPs) und MicroRNA-haltigen-Gebiets-komplexe (MiRNPs) in einer Art von Zelle abh&auml;ngigen Weise ausgedr&uuml;ckt. Wir entwickelten einen zellbasierte vernetzender Ansatz um die Bindungsstellen der zellul&auml;ren RBPs und MiRNPs bei hoher Aufl&ouml;sung und Transkriptom-weite zu bestimmen. Die vernetzte Standorte sind durch Thymidin zu Cytidin &Uuml;berg&auml;nge in die cDNAs aus Immunopurified RNPs 4-Thiouridine-behandelte Zellen vorbereitet offenbart. Wir entschlossen die Bindungsstellen und regulatorische Konsequenzen f&uuml;r mehrere intensiv studierte RBPs und MiRNPs, einschlie&szlig;lich PUM2, QKI, IGF2BP1-3, her/EIF2C1-4 und TNRC6A-C. Unsere Studie ergab, dass diese Faktoren binden Tausende von Seiten mit definierten Sequenz Motive und unterschiedliche Vorlieben haben f&uuml;r exonic versus verband intronic oder Codierung gegen&uuml;ber nicht &uuml;bersetzte Abschrift Regionen. Die genaue Zuordnung der Bindung von Websites &uuml;ber das Transkriptom ist entscheidend, um die Interpretation der sich schnell verbreitende Daten auf genetische Variation zwischen Individuen und wie diese Variationen zu komplexen genetischen Erkrankungen beitragen.

Transkriptom-weite Identifikation von RNS-bindene Protein und MicroRNA Ziel-Sites von PAR-CLIP.

Animal mRNAs are regulated by hundreds of RNA binding proteins (RBPs). The identification of RBP targets is crucial for understanding their function. A recent method, PAR-CLIP, uses photoreactive nucleosides to crosslink RBPs to target RNAs in cells prior to immunoprecipitation. Here, we establish iPAR-CLIP (in vivo PAR-CLIP) to determine, at nucleotide resolution, transcriptome-wide binding sites of GLD-1, a conserved, germline-specific translational repressor in C. elegans. We identified 439 reproducible target mRNAs and demonstrate an excellent dynamic range of target detection by iPAR-CLIP. Upon GLD-1 knockdown, protein but not mRNA expression of the 439 targets was specifically upregulated, demonstrating functionality. Finally, we discovered strongly conserved GLD-1 binding sites near the start codon of target genes. These sites are functional in vitro and likely confer strong repression in vivo. We propose that GLD-1 interacts with the translation machinery near the start codon, a so-far-unknown mode of gene regulation in eukaryotes.

In vivo and transcriptome-wide identification of RNA binding protein target sites.

Tierische mRNAs sind Hunderte von RNA-bindende Proteine (RBPs) geregelt. Die Identifizierung von RBP Zielen ist entscheidend f&uuml;r das Verst&auml;ndnis ihrer Funktion. Eine neue Methode, PAR-CLIP, photoreaktive Nucleoside zu Crosslink RBPs Ziel RNAs in Zellen vor Immunopr&auml;zipitation verwendet. Hier errichten wir iPAR-CLIP (in-vivo PAR-CLIP) um zu bestimmen, bei Nukleotid-Aufl&ouml;sung, Transkriptom-weite Bindungsstellen der GLD-1, ein konserviertes, Keimbahn-spezifische translational Verdr&auml;nger in C. Elegans. Wir identifizierten 439 reproduzierbare Ziel mRNAs und zeigen einen ausgezeichneten Dynamikumfang des Ziel-Erkennung von iPAR-CLIP. GLD-1 Niederschlag, Protein, aber keine mRNA Ausdruck der 439 Ziele wurde speziell herraufreguliert, Funktionalit&auml;t zu demonstrieren. Schlie&szlig;lich entdeckten wir stark konservierte Bindungsstellen der GLD-1 nahe dem Startcodon Zielgene. Dieser Sites sind funktionell in Vitro und wahrscheinlich in-vivo starke Unterdr&uuml;ckung zu &uuml;bertragen. Wir schlagen die &Uuml;bersetzung Maschinerie nahe dem Startcodon, ein so-weit-unbekannt-Modus der Genregulation bei Eukaryoten GLD-1 interagiert.

Article	Year
Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell\| PubMed ID: 20371350	2010
Molecular biology of the cell\| PubMed ID: 20926683	2010
In vivo and transcriptome-wide identification of RNA binding protein target sites. Molecular cell\| PubMed ID: 22152485	2011

Anna-Carina Jungkamp

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