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Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

To explore interactions between the epithelial Na channel (ENaC) and neural precursor expressed, developmentally downregulated protein 4-2 (Nedd4-2) at the conversion of the rat lung from fluid secretion to absorption at birth, we used small-interfering RNA (siRNA) against alphaENaC and Nedd4-2. siRNA-generating plasmid DNA (pDNA) was administered via trans-thoracic intrapulmonary (ttip) injection 24 h before ENaC and Nedd4-2 expression, extravascular lung water, and mortality were measured. alphaENaC mRNA and protein were specifically reduced by approximately 65% after pSi-4 injection. Nedd4-2 mRNA and protein were reduced by approximately 60% after pSi-N1 injection. Interestingly, alphaENaC and betaENaC mRNA and protein expression were increased after Nedd4-2 silencing. Extravascular lung water was significantly increased after alphaENaC silencing and reduced after Nedd4-2 silencing. alphaENaC silencing resulted in a fourfold increase in newborn mortality, whereas silencing Nedd4-2 did not affect mortality. We also isolated distal lung epithelial (DLE) cells after in vivo alphaENaC or Nedd4-2 silencing and measured alphaENaC or Nedd4-2 expression in freshly isolated DLE cells. In these DLE cells, there were attenuated alphaENaC or Nedd4-2 mRNA and protein, thus demonstrating that alphaENaC and Nedd4-2 silencing occurred in alveolar epithelial cells after ttip injection. We also looked for pDNA by PCR to determine pDNA presence in the lungs and found strong evidence for pDNA presence in both lungs. Thus we provide evidence that ENaC and Nedd4-2 are involved in the transition from lung fluid secretion to fluid absorption near term and at birth.

Involvement of {alpha}ENaC and Nedd4-2 in the conversion from lung fluid secretion to fluid absorption at birth in the rat as assayed by RNA interference analysis.

Um Wechselwirkungen zwischen der epithelialen Na-Kanal (ENaC) und neuronale Vorl&auml;ufer ausgedr&uuml;ckt, entwicklungspolitisch Downregulated Protein 4-2 (Nedd4-2) bei der Konvertierung der Ratte-Lunge von Fl&uuml;ssigkeit Sekretion zu Absorption bei der Geburt zu erkunden haben wir kleine Eingriffe RNA (SiRNA) gegen AlphaENaC und Nedd4-2 verwendet. SiRNA-Generieren von Plasmid-DNA (pDNA) wurde mittels Injektion Trans-thoracic intrapulmonalen (Ttip) 24 h verabreicht, bevor ENaC und Nedd4-2 Ausdruck, extravaskul&auml;rer Lunge Wasser und Sterblichkeit gemessen wurden. AlphaENaC mRNA und Protein wurden speziell von ca. 65 % nach der pSi-4 Injektion reduziert. Nedd4-2 mRNA und Protein wurden nach der pSi-N1-Injektion von ca. 60 % reduziert. Interessanterweise wurden die mRNA und Protein-Ausdruck f&uuml;r AlphaENaC und BetaENaC nach Nedd4-2 Unterdr&uuml;ckender erh&ouml;ht. Extravaskul&auml;ren Lunge Wasser wurde deutlich erh&ouml;ht nach AlphaENaC zum Schweigen und reduziert nach Nedd4-2 zum Schweigen. AlphaENaC zum Schweigen ergab eine Vervierfachung Neugeborenen Sterblichkeit, Unterdr&uuml;ckender Nedd4-2 Sterblichkeit nicht ber&uuml;hrt. Wir auch isolierte distale Lunge Epithelzellen (DLE) nach in-vivo-AlphaENaC oder Nedd4-2 zum Schweigen und AlphaENaC oder Nedd4-2-Ausdrucks in frisch isolierten DLE Zellen gemessen. In diesen Zellen DLE gab abgeschw&auml;chte AlphaENaC oder Nedd4-2 mRNA und Protein, also zeigen, dass AlphaENaC und Nedd4-2 Unterdr&uuml;ckender alveolaren Epithelzellen nach Ttip Injektion aufgetreten. Wir haben uns auch f&uuml;r pDNA durch PCR bestimmen pDNA Pr&auml;senz in der Lunge und starke Beweise f&uuml;r pDNA Pr&auml;senz in beiden Lungen gefunden. Daher bieten wir Hinweise, dass der &Uuml;bergang von Lunge Fl&uuml;ssigkeit Sekretion zu fl&uuml;ssigen Absorption kurzfristig und bei der Geburt ENaC und Nedd4-2 beteiligt sind.

Einbeziehung von {alpha} ENaC und Nedd4-2 bei der Umwandlung von Lunge Fl&uuml;ssigkeit Sekretion in fl&uuml;ssigen Absorption bei Geburt in der Ratte als durch RNA-Interferenz-Analyse untersucht.

We tested the hypothesis that maternal interleukin-1beta (IL-1beta) pretreatment and induction of fetal cortisol synthesis activates MAP kinases and thereby affects lung fluid absorption in preterm guinea pigs.

Stimulation of MAP kinase pathways after maternal IL-1beta exposure induces fetal lung fluid absorption in guinea pigs.

Wir testeten der Hypothese, dass m&uuml;tterliche Interleukin-1beta (IL-1beta) Vorbehandlung und Induktion der fetalen Cortisol-Synthese MAP-Kinasen aktiviert und wirkt sich somit Lunge fl&uuml;ssig Resorption bei Fr&uuml;hgeborenen Meerschweinchen.

Stimulation der MAP-Kinase-Wege nach der m&uuml;tterlichen IL-1beta Exposition induziert fetalen Lunge fl&uuml;ssige Absorption im Meerschweinchen.

Small interfering RNA (siRNA) against alphaENaC (alpha-subunit of the epithelial Na channel) and CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) was used to explore ENaC and CTFR function in newborn rat lungs.

RNA interference for CFTR attenuates lung fluid absorption at birth in rats.

Small interfering RNA (SiRNA) gegen AlphaENaC (Alpha-Untereinheit des epithelialen Na-Kanal) und CFTR (Cystic Fibrosis transmembrane Conductance Regulator) wurde zur ENaC und CTFR Funktion in Neugeborene Ratte Lunge zu erkunden.

RNA-Interferenz f&uuml;r CFTR d&auml;mpft Lunge fl&uuml;ssige Absorption bei Geburt bei Ratten.

We tested the hypothesis that interleukin (IL)-1beta-induced cortisol synthesis stimulates distal lung fluid absorption in fetal guinea pigs via induction of serum- and glucocorticoid-regulated kinase (SGK) and inhibition of neural precursor cell expressed, developmentally downregulated protein 4-2 (Nedd4-2). IL-1beta was subcutaneously administered daily to timed-pregnant guinea pigs over 3 days. Fetuses were obtained by abdominal hysterotomy at gestation day (GD)61 and GD68 and instilled with an isosmolar 5% albumin solution into the lungs. Distal lung fluid movement was measured over 1 h from the change in distal air space protein concentration. Fetal lungs were secreting lung fluid at GD61 while absorbing lung fluid at GD68. Distal lung fluid absorption was induced at GD61 by IL-1beta but unaffected at GD68. Plasma cortisol concentrations were increased by IL-1beta at GD61 and endogenously at GD68. Distal lung fluid absorption was measured and correlated to SGK and Nedd4-2 expression and to alpha-epithelial Na channel (ENaC) expression. SGK was increased by IL-1beta and late during gestation (GD68), while Nedd4-2 was decreased by IL-1beta and late during gestation. alpha-ENaC was induced by IL-1beta at GD61 and increased late during gestation. Thus our study suggests that cortisol-stimulated fetal lung fluid absorption is mediated by increased ENaC expression and may be governed by the SGK/Nedd4-2 pathway. These observations may explain why babies delivered preterm after intrauterine inflammation have a reduced risk of developing severe respiratory distress.

IL-1beta-induced cortisol stimulates lung fluid absorption in fetal guinea pigs via SGK-mediated Nedd4-2 inhibition.

Wir testeten die Hypothese, dass Interleukin (IL) - 1beta - induzierte Cortisol-Synthese stimuliert distale Lunge fl&uuml;ssige Absorption im fetalen Meerschweinchen &uuml;ber Induktion von Serum und Glukokortikoid-regulierte Kinase (SGK) und Hemmung der neuronalen Vorl&auml;ufer Zelle ausgedr&uuml;ckt, entwicklungspolitisch Downregulated Protein 4-2 (Nedd4-2). IL-1beta wurde subkutan t&auml;glich zeitlich-Schwangere Meerschweinchen &uuml;ber 3 Tage verabreicht. F&ouml;ten wurden gewonnen durch Abdominal-Geb&auml;rmutterer&ouml;ffnung am Tag der Tr&auml;chtigkeit (GD) 61 und GD68 und mit einer Isosmolar 5 % Albumin-L&ouml;sung in die Lungen eingefl&ouml;&szlig;t. Distale Lunge flie&szlig;ende Bewegung wurde &uuml;ber 1 h aus der &Auml;nderung im distalen Luftraum-Protein-Konzentration gemessen. Fetale Lungen waren Lunge hei&szlig;e Fl&uuml;ssigkeit GD61 sezernierende, w&auml;hrend absorbieren Fl&uuml;ssigkeit der Lunge bei GD68. Distale Lunge fl&uuml;ssig Resorption war induzierte bei GD61 von IL-1beta aber unber&uuml;hrt bei GD68. Plasma-Cortisol-Konzentration stieg durch IL-1beta GD61 und endogen GD68. Distale Lunge fl&uuml;ssige Absorption wurde gemessen und korreliert, die Ausdruck SGK und Nedd4-2, Alpha-epithelialer Na Kanal (ENaC) Ausdruck. SGK war von IL-1beta erh&ouml;ht werden und w&auml;hrend der Schwangerschaft (GD68), sp&auml;te Nedd4-2 verringerte von IL-1beta und sp&auml;t w&auml;hrend der Schwangerschaft. Alpha-ENaC wurde von IL-1beta bei GD61 induziert und sp&auml;t w&auml;hrend der Schwangerschaft erh&ouml;ht. So schl&auml;gt unsere Studie, dass Cortisol stimuliert fetale Lunge fl&uuml;ssige Absorption durch erh&ouml;hte ENaC Expression vermittelt wird und durch die SGK/Nedd4-2-Weg geregelt werden kann. Diese Beobachtungen k&ouml;nnte erkl&auml;ren, warum Babys Fr&uuml;hgeburten geliefert, nachdem intrauterine Entz&uuml;ndung haben ein geringeres Risiko f&uuml;r die Entwicklung schwerer Atemnot.

IL-1beta induziert Cortisol stimuliert Lunge fl&uuml;ssige Absorption im fetalen Meerschweinchen &uuml;ber SGK-vermittelte Nedd4-2-Hemmung.

The alveolar epithelium plays a critical role in resolving pulmonary edema. We thus hypothesized that its function might be upregulated in rats with heart failure, a condition that severely challenges the lung's ability to maintain fluid balance. Heart failure was induced by left coronary artery ligation. Echocardiographic and cardiovascular hemodynamics confirmed its development at 16 wk postligation. At that time, alveolar fluid clearance was measured by an increase in protein concentration over 1 h of a 5% albumin solution instilled into the lungs. Baseline alveolar fluid clearance was similar in heart failure and age-matched control rats. Terbutaline was added to the instillate to determine whether heart failure rats responded to beta-adrenoceptor stimulation. Alveolar fluid clearance in heart failure rats was increased by 194% after terbutaline stimulation compared with a 153% increase by terbutaline in control rats. To determine the mechanisms responsible for this accelerated alveolar fluid clearance, we measured ion transporter expression (ENaC, Na-K- ATPase, CFTR). No significant upregulation was observed for these ion transporters in the heart failure rats. Lung morphology showed significant alveolar epithelial type II cell hyperplasia in heart failure rats. Thus, alveolar epithelial type II cell hyperplasia is the likely explanation for the increased terbutaline-stimulated alveolar fluid clearance in heart failure rats. These data provide evidence for previously unrecognized mechanisms that can protect against or hasten resolution of alveolar edema in heart failure.

Beta-adrenoceptor stimulation of alveolar fluid clearance is increased in rats with heart failure.

Das alveol&auml;re Epithel spielt eine wichtige Rolle bei der L&ouml;sung von Lungen&ouml;dem. Damit wir die Hypothese, dass seine Funktion m&ouml;glicherweise herraufreguliert bei Ratten mit Herzinsuffizienz, eine Bedingung, die die Lunge F&auml;higkeit zur Fl&uuml;ssigkeitsbilanz stark herausfordert. Herzinsuffizienz wurde durch linke Koronararterie Ligaturen induziert. Intertrabekul&auml;re und kardiovaskul&auml;re H&auml;modynamik best&auml;tigt seine Entwicklung bei 16 wk Postligation. Damals wurde durch eine Erh&ouml;hung der Protein-Konzentration &uuml;ber 1 h einer 5 % Albumin-L&ouml;sung in die Lungen eingefl&ouml;&szlig;t alveol&auml;re Fl&uuml;ssigkeit Abstand gemessen. Grundlinie alveol&auml;re Fl&uuml;ssigkeit Abstand &auml;hnelte in altersbezogenen Steuerelement Ratten und Herzinsuffizienz. Terbutalin wurde hinzugef&uuml;gt, um die Instillate zu bestimmen, ob Herzinsuffizienz Ratten auf Beta-Adrenozeptor-Stimulation reagiert. Alveol&auml;re Fl&uuml;ssigkeit Abfertigung bei Herzinsuffizienz Ratten wurde nach Terbutalin Stimulation gegen&uuml;ber einem 153 Prozent von Terbutalin Steuerelement Ratten durch 194 % erh&ouml;ht. Um die Mechanismen, die zu bestimmen f&uuml;r dies alveol&auml;re Fl&uuml;ssigkeit Freiraum beschleunigte, gemessen wir Ion Transporter Ausdruck (ENaC, Na-K-ATPase, CFTR). Keine wesentlichen Fehlregulation wurde diese Ionen-Transporter in der Herzinsuffizienz-Ratten beobachtet. Lung Morphologie zeigte deutliche alveol&auml;re Epithel Typ II Zelle Hyperplasie bei Herzinsuffizienz Ratten. So ist alveol&auml;re Epithel Typ II Zelle Hyperplasie die wahrscheinliche Erkl&auml;rung f&uuml;r die erh&ouml;hten Terbutalin stimuliert alveol&auml;re Fl&uuml;ssigkeit Lagerluft Herzinsuffizienz Ratten. Diese Daten liefern Hinweise auf bisher unbekannte Mechanismen, die Schutz vor oder Aufl&ouml;sung der alveol&auml;re &Ouml;dem in Herzinsuffizienz zu beschleunigen k&ouml;nnen.

Beta-Adrenozeptor Stimulierung der alveol&auml;re Fl&uuml;ssigkeit Clearance wird bei Ratten mit Herzinsuffizienz erh&ouml;ht.

The objective of this study was to determine if low tidal volume (V(t)) ventilation was beneficial when ventilating preterm fetuses. The authors ventilated preterm guinea pig fetuses at gestation day (GD) 67, 3 days before birth, newborn, and 10-day-old (PD10) guinea pigs with low V(t) (6 mL/kg body weight [bw]) and compared them to age-matched fetuses/animals ventilated with higher potentially injurious V(t) (12 mL/kg bw). Lung fluid absorption was measured after intratracheal instillation of 5% albumin in 0.9% NaCl. Low V(t) ventilation stimulated lung fluid absorption when compared to higher V(t) in all groups. The increased lung fluid absorption in low V(t)-ventilated fetuses was associated with increased Î± epithelial Na channel (Î±EnaC) mRNA. However, Î±ENaC and Î²ENaC protein was unchanged over the 1-hour study. Because stretch induces mitogen-activated protein (MAP) kinase expression and MAP kinases may affect lung fluid absorption, the authors investigated if MAP kinase (MAPK) expression was affected by V(t). Extracellular signal-regulated kinase (ERK) and MAPK/ERK kinase (MEK) were phosphorylated in the higher V(t)-ventilated guinea pig fetuses. This suggested that a reduced activation of MAP kinases might explain the increased lung fluid absorption in the low V(t)-ventilated fetuses. Thus these data suggest that low V(t) ventilation increases fetal lung fluid absorption and thus may be preferential to use clinically.

Lung fluid absorption is induced in preterm guinea pigs ventilated with low tidal volumes.

Das Ziel dieser Studie war es, festzustellen, wenn niedrige Tidalvolumen (V(t)) L&uuml;ftung war vorteilhaft, als Fr&uuml;hgeburt F&ouml;ten L&uuml;ftung. Die Autoren bel&uuml;ftet Fr&uuml;hgeburt Meerschweinchen F&ouml;ten bei Tr&auml;chtigkeit Tag (GD) 67, 3 Tage vor der Geburt, Neugeborene, und 10 Tage alten (PD10) Meerschweinchen mit niedrigen V(t) (6 mL/kg K&ouml;rpergewicht [bw]) und verglichen sie altersbezogenen F&ouml;ten/Tiere hinterl&uuml;ftet mit h&ouml;heren potenziell sch&auml;digenden V(t) (12 mL/kg bw). Lung fl&uuml;ssig Resorption nach intratracheale Instillation von 5 % Albumin in 0,9 % gemessen wurde NaCl. Low V(t) L&uuml;ftung stimuliert Lunge fl&uuml;ssig Resorption im Vergleich zu h&ouml;heren V(t) in allen Gruppen. Die erh&ouml;hte Lunge fl&uuml;ssige Absorption in niedrigen V (t)-bel&uuml;ftete F&ouml;ten wurde mit erh&ouml;hten &alpha; epithelialer Na-Kanal (&alpha;EnaC) mRNA. &Alpha;ENaC und &beta;ENaC Protein war jedoch &uuml;ber die 1-Stunden-Studie unver&auml;ndert. Da Strecke Mitogen-aktivierte Protein (MAP) Kinase-Ausdruck induziert und MAP-Kinasen k&ouml;nnen Lunge fl&uuml;ssig Resorption beeintr&auml;chtigen, die Autoren untersucht, ob MAP Kinase (MAPK) Ausdruck von V(t) betroffen war. Extrazellul&auml;re Signal-regulierte Kinase (ERK) und MAPK/ERK-Kinase (MEK) wurden in der h&ouml;heren V (t) phosphoryliert-Meerschweinchen F&ouml;ten bel&uuml;ftet. Dies vorgeschlagen, dass eine geringere Aktivierung der MAP-Kinasen, die erh&ouml;hte Lunge fl&uuml;ssige Absorption in der niedrigen V (t) erkl&auml;ren k&ouml;nnten-F&ouml;ten bel&uuml;ftet. Daher empfehlen diese Daten niedrigen V(t) L&uuml;ftung erh&ouml;ht fetalen Lunge fl&uuml;ssige Absorption und somit m&ouml;glicherweise bevorzugt, klinisch zu verwenden.

Lung fl&uuml;ssig Resorption wird bei Fr&uuml;hgeborenen Meerschweinchen hinterl&uuml;ftet mit niedrigen Atemzugvolumina induziert.

Fibroblast-wie Synoviocytes (FLS) spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis (RA). Kaliumkan&auml;le haben regulatorische Rollen in vielen Funktionen der Zelle. Wir haben den Kalzium - und Spannung-gated KCa1.1 Kanal (BK, Maxi-K, Slo1, KCNMA1) als in der Plasmamembran von FLS isoliert von Patienten mit RA (RA-FLS) bekundeten gro&szlig;en Kaliumkanals identifiziert. Wir weiter zeigen, dass die Blockierung dieser Kanal w&uuml;hlt die Kalzium-Hom&ouml;ostase der Zellen und hemmt die Vermehrung, Produktion von VEGF, IL-8, und Pro-MMP-2, Migration und Invasion der RA-FLS. Unsere Ergebnisse zeigen eine regulatorische Rolle KCa1.1 Kan&auml;le in RA-FLS-Funktion und schlagen Sie diesen Kanal als m&ouml;gliches Angriffsziel f&uuml;r die Behandlung der RA.

KCa1.1 Kaliumkan&auml;le Regeln wichtige Proinflammatory und Invasive Eigenschaften des Fibroblasten-&auml;hnliche Synoviocytes bei rheumatoider Arthritis.

Fibroblast-like synoviocytes (FLS) play important roles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). Potassium channels have regulatory roles in many cell functions. We have identified the calcium- and voltage-gated KCa1.1 channel (BK, Maxi-K, Slo1, KCNMA1) as the major potassium channel expressed at the plasma membrane of FLS isolated from patients with RA (RA-FLS). We further show that blocking this channel perturbs the calcium homeostasis of the cells and inhibits the proliferation, production of VEGF, IL-8, and pro-MMP-2, and migration and invasion of RA-FLS. Our findings indicate a regulatory role of KCa1.1 channels in RA-FLS function and suggest this channel as a potential target for the treatment of RA.

Article	Year
Involvement of {alpha}ENaC and Nedd4-2 in the conversion from lung fluid secretion to fluid absorption at birth in the rat as assayed by RNA interference analysis. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology\| PubMed ID: 17693485	2007
Stimulation of MAP kinase pathways after maternal IL-1beta exposure induces fetal lung fluid absorption in guinea pigs. Respiratory research\| PubMed ID: 17386088	2007
RNA interference for CFTR attenuates lung fluid absorption at birth in rats. Respiratory research\| PubMed ID: 18652671	2008
IL-1beta-induced cortisol stimulates lung fluid absorption in fetal guinea pigs via SGK-mediated Nedd4-2 inhibition. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology\| PubMed ID: 19136575	2009
Beta-adrenoceptor stimulation of alveolar fluid clearance is increased in rats with heart failure. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology\| PubMed ID: 19592457	2009
Lung fluid absorption is induced in preterm guinea pigs ventilated with low tidal volumes. Experimental lung research\| PubMed ID: 21077781	2011
KCa1.1 Potassium Channels Regulate Key Proinflammatory and Invasive Properties of Fibroblast-like Synoviocytes in Rheumatoid Arthritis. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 22074915	2012

Shyny Koshy

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