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Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

To determine the ability of different types of gadolinium-based contrast agents (GBCAs) to stimulate fibroblast proliferation in monolayer cell culture.

Effect of different classes of gadolinium-based contrast agents on control and nephrogenic systemic fibrosis-derived fibroblast proliferation.

Um zu bestimmen, die F&auml;higkeit der verschiedenen Arten von Gadolinium-basierte Kontrastmittel (GBCAs), Fibroblasten-Proliferation im Monolage Zellkultur zu stimulieren.

Wirkung der verschiedenen Klassen Gadolinium-basierte Kontrastmittel auf Kontrolle und Nephrogene systemische Fibrose abgeleitete Fibroblasten-Proliferation.

PTEN tumor suppressor gene failure in ras(Ha)-activated skin carcinogenesis was investigated by mating exon 5 floxed-PTEN (Delta5PTEN) mice to HK1.ras mice that expressed a RU486-inducible cre recombinase (K14.creP). PTEN inactivation in K14.cre/PTEN(flx/flx) keratinocytes resulted in epidermal hyperplasia/hyperkeratosis and novel 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-promoted papillomas, whereas HK1.ras/K14.cre/PTEN(flx/flx) cohorts displayed a rapid onset of papillomatogenesis due to a synergism of increased AKT activity and extracellular signal-regulated kinase (ERK) elevation. High 5-bromo-4-deoxyuridine labeling in Delta5PTEN papillomas showed that a second promotion mechanism centered on failures in cell cycle control. Elevated cyclin D1 was associated with both HK1.ras/ERK- and Delta5PTEN-mediated AKT signaling, whereas cyclin E2 overexpression seemed dependent on PTEN loss. Spontaneous HK1.ras/Delta5PTEN malignant conversion was rare, whereas TPA promotion resulted in conversion with high frequency. On comparison with all previous HK1.ras carcinomas, such TPA-induced carcinomas expressed atypical retention of keratin K1 and lack of K13, a unique marker profile exhibited by TPA-induced K14.cre/PTEN(flx/flx) papillomas that also lacked endogenous c-ras(Ha) activation. Moreover, in all PTEN-null tumors, levels of ras(Ha)-associated total ERK protein became reduced, whereas phosphorylated ERK and cyclin D1 were lowered in late-stage papillomas returning to elevated levels, alongside increased cyclin E2 expression, in TPA-derived carcinomas. Thus, during early papillomatogenesis, PTEN loss promotes ras(Ha) initiation via elevation of AKT activity and synergistic failures in cyclin regulation. However, in progression, reduced ras(Ha)-associated ERK protein and activity, increased Delta5PTEN-associated cyclin E2 expression, and unique K1/K13 profiles following TPA treatment suggest that PTEN loss, rather than ras(Ha) activation, gives rise to a population of cells with greater malignant potential.

PTEN loss promotes rasHa-mediated papillomatogenesis via dual up-regulation of AKT activity and cell cycle deregulation but malignant conversion proceeds via PTEN-associated pathways.

PTEN Tumorsuppressor Gen Scheitern in Ras (Ha)-aktivierten Haut Karzinogenese wurde untersucht durch Paarung Exon 5 Floxed-PTEN (Delta5PTEN) M&auml;use auf HK1.ras-M&auml;use, die eine RU486-inducible Cre Recombinase (K14.creP) ausgedr&uuml;ckt. PTEN Inaktivierung in K14.cre/PTEN(flx/flx) Keratinozyten f&uuml;hrte epidermalen Hyperplasie/Hyperkeratose und neuartige 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA)-Papillome, gef&ouml;rdert, w&auml;hrend HK1.ras/K14.cre/PTEN(flx/flx) Kohorten einen raschen Beginn der Papillomatogenesis durch ein Synergismus der erh&ouml;hten Aktivit&auml;t der AKT und extrazellul&auml;re Signal-regulierte Kinase (ERK) H&ouml;he angezeigt. Hohe 5-Bromo-4-Deoxyuridine Kennzeichnung in Delta5PTEN Papillome haben gezeigt, dass einen zweiten F&ouml;rderung-Mechanismus auf Fehler im Zellzyklus-Steuerelement zentriert. Erh&ouml;hten cyclin D1 wurde mit beide HK1.ras/ERK - und Delta5PTEN-vermittelter AKT signalisieren, w&auml;hrend cyclin E2-&Uuml;berexpression PTEN Verlust abh&auml;ngig schien. Spontane HK1.ras/Delta5PTEN maligne Umwandlung war selten, w&auml;hrend Konvertierung mit Hochfrequenz TPA F&ouml;rderung gef&uuml;hrt. Im Vergleich mit allen vorherigen HK1.ras Karzinomen ausgedr&uuml;ckt solche TPA-induzierte Karzinome atypische Speicherung von Keratin K1 und mangelnde K13, eine eindeutige Markierung Profil ausgestellt von TPA-induzierte K14.cre/PTEN(flx/flx) Papillome, die auch die Aktivierung des endogenen c-ras(Ha) fehlten. Dar&uuml;ber hinaus in allen PTEN-Null Tumoren, Ebenen der Ras (Ha)-assoziierten Gesamtprotein ERK wurde reduziert, w&auml;hrend phosphorylierten ERK und cyclin D1 im Sp&auml;tstadium Papillome wieder auf erh&ouml;hte Niveaus gesenkt wurden, neben erh&ouml;ht cyclin E2 Ausdruck im TPA abgeleiteten Karzinomen. Somit f&ouml;rdert PTEN Verlust w&auml;hrend der fr&uuml;hen Papillomatogenesis, ras(Ha) Einleitung &uuml;ber H&ouml;he von AKT-Aktivit&auml;t und synergistische Versagen cyclin Verordnung. Jedoch im Fortschreiten, verringert Ras (Ha)-assoziierten ERK-Protein und Aktivit&auml;t, erh&ouml;hte Delta5PTEN-assoziierte cyclin E2 Expression und einzigartige K1/K13-Profilen nach TPA Behandlung vorschlagen, dass PTEN Verlust, sondern als ras(Ha)-Aktivierung, gibt Anlass zu einer Bev&ouml;lkerung der Zellen mit gr&ouml;&szlig;eren malignes Potenzial.

PTEN Verlust f&ouml;rdert RasHa-vermittelte Papillomatogenesis &uuml;ber dual-bis-Verordnung der AKT-Aktivit&auml;t und der Zellzyklus Deregulierung, aber b&ouml;sartige Umwandlung geht &uuml;ber PTEN-assoziierte Wege.

To investigate gene synergism in multistage skin carcinogenesis, the RU486-inducible cre/lox system was employed to ablate Pten function (K14.cre/Delta5Pten flx) in mouse epidermis expressing activated Fos (HK1.Fos). RU486-treated HK1.Fos/Delta5Pten flx mice exhibited hyperplasia, hyperkeratosis and tumours that progressed to highly differentiated keratoacanthomas, rather than to carcinomas, owing to re-expression of high p53 and p21 WAF levels. Despite elevated MAP kinase activity, cyclin D1 and cyclin E2 overexpression, and increased AKT activity that produced areas of highly proliferative papillomatous keratinocytes, increasing levels of GSK3beta inactivation induced a novel p53/p21 WAF expression profile, which subsequently halted proliferation and accelerated differentiation to give the hallmark keratosis of keratoacanthomas. A pivotal facet to this GSK3beta-triggered mechanism centred on increasing p53 expression in basal layer keratinocytes. This increase in expression reduced activated AKT expression and released inhibition of p21 WAF, which accelerated keratinocyte differentiation, as indicated by unique basal layer expression of differentiation-specific keratin K1 alongside premature filaggrin and loricrin expression. Thus, Fos synergism with Pten loss elicited a benign tumour context where GSK3beta-induced p53/p21 WAF expression continually switched AKT-associated proliferation into differentiation, preventing further progression. This putative compensatory mechanism required the critical availability of normal p53 and/or p21 WAF, otherwise deregulated Fos, Akt and Gsk3beta associate with malignant progression.

Fos cooperation with PTEN loss elicits keratoacanthoma not carcinoma, owing to p53/p21 WAF-induced differentiation triggered by GSK3beta inactivation and reduced AKT activity.

Um gen Synergismus in mehrstufigen Haut Karzinogenese zu untersuchen, wurde das RU486-inducible Cre/Lox-System eingesetzt, um entfernen Pten-Funktion (K14.cre/Delta5Pten Flx) in Maus Oberhaut Ausdr&uuml;cken aktivierte Fos (HK1.Fos). RU486 behandelten HK1.Fos/Delta5Pten Flx M&auml;use ausgestellt, Hyperkeratose, Hyperplasie und Tumore, die zu hoch differenzierte Keratoacanthomas anstatt zu Karzinome, aufgrund der Re-expression von hoher p53 und p21 WAF fortgeschritten. Trotz erh&ouml;hter MAP-Kinase-Aktivit&auml;t, cyclin D1 und cyclin E2-&Uuml;berexpression und erh&ouml;hte AKT-Aktivit&auml;t, die Bereiche der stark proliferativ papillomatous Keratinozyten produziert, induzierte vermehrter GSK3beta Inaktivierung eine neuartige p53/p21 WAF Ausdruck Profil, das sp&auml;ter Verbreitung gestoppt und beschleunigte Differenzierung zu geben, die Keratose Markenzeichen des Keratoacanthomas. Eine zentrale Facette zu diesem GSK3beta ausgel&ouml;ste Mechanismus erh&ouml;ht p53 Ausdruck in der basalen Schicht Keratinocytes standen. Dieser Anstieg der Ausdruck reduziert aktiviert AKT Ausdruck und Hemmung der p21 WAF, der Differenzierung der Keratinozyten, beschleunigt durch einzigartige basale Schicht Ausdruck der Differenzierung-spezifische Keratin K1 neben vorzeitiger Filaggrin und Loricrin Ausdruck freigegeben. So l&ouml;ste Fos Synergismus mit Pten Verlust einen gutartiger Tumor-Kontext, wo GSK3beta induziert p53/p21 WAF Ausdruck st&auml;ndig AKT-assoziierte Vermehrung in Differenzierung wechselte, weiteres Fortschreiten zu verhindern. Diese vermeintliche Ausgleichsmechanismus ben&ouml;tigt die kritische Verf&uuml;gbarkeit von normalen p53 bzw. p21 WAF, ansonsten deregulierten Fos, Akt und Gsk3beta ordnen maligne Progression.

Fos Zusammenarbeit mit PTEN Verlust entlockt Keratoakanthom nicht Karzinom, aufgrund p53/p21 induziert durch WAF Differenzierung durch Inaktivierung des GSK3beta ausgel&ouml;st und reduzierter Aktivit&auml;t AKT.

The ability to observe changes in molecular behavior during cancer cell invasion in vivo remains a major challenge to our understanding of the metastatic process. Here, we demonstrate for the first time, an analysis of RhoA activity at a subcellular level using FLIM-FRET (fluorescence lifetime imaging microscopy-fluorescence resonance energy transfer) imaging in a live animal model of pancreatic cancer. In invasive mouse pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells driven by mutant p53 (p53(R172H)), we observed a discrete fraction of high RhoA activity at both the leading edge and rear of cells in vivo which was absent in two-dimensional in vitro cultures. Notably, this pool of active RhoA was absent in noninvasive p53(fl) knockout PDAC cells, correlating with their poor invasive potential in vivo. We used dasatanib, a clinically approved anti-invasive agent that is active in this model, to illustrate the functional importance of spatially regulated RhoA. Dasatanib inhibited the activity of RhoA at the poles of p53(R172H) cells in vivo and this effect was independent of basal RhoA activity within the cell body. Taken together, quantitative in vivo fluorescence lifetime imaging illustrated that RhoA is not only necessary for invasion, but also that subcellular spatial regulation of RhoA activity, as opposed to its global activity, is likely to govern invasion efficiency in vivo. Our findings reveal the utility of FLIM-FRET in analyzing dynamic biomarkers during drug treatment in living animals, and they also show how discrete intracellular molecular pools might be differentially manipulated by future anti-invasive therapies.

Spatial regulation of RhoA activity during pancreatic cancer cell invasion driven by mutant p53.

Die M&ouml;glichkeit, &Auml;nderungen im molekularen Verhalten w&auml;hrend Krebs Zelle Invasion in-vivo zu beobachten bleibt eine gro&szlig;e Herausforderung f&uuml;r unser Verst&auml;ndnis des metastasierenden Prozesses. Hier zeigen wir zum ersten Mal, eine Analyse der RhoA Aktivit&auml;t auf eine subzellul&auml;re Ebene mithilfe von FLIM-FRET (Fluoreszenz Lifetime imaging Mikroskopie-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) Bildgebung in einem Leben Tiermodell von Bauchspeicheldr&uuml;senkrebs. Invasive Maus Zellen pankreatische duktale Adenokarzinom (PDAC) getrieben von mutierten p53 (p53(R172H)), wir beobachteten eine diskrete Bruchteil der hohe RhoA-Aktivit&auml;t an der Spitze und hinten von Zellen in-vivo die abwesend war in zweidimensionalen in-vitro-Kulturen. Vor allem, diesen Pool an aktiven RhoA fehlte in nicht-invasive p53(fl) k.o. PDAC Zellen, Korrelation mit ihren Armen invasive Potential in-vivo. Wir verwendeten Dasatanib, einen klinisch zugelassenen anti-invasive Agent, der in diesem Modell die funktionelle Bedeutung des r&auml;umlich geregelten RhoA veranschaulichen aktiv ist. Dasatanib gehemmt die Aktivit&auml;t von RhoA an den Polen der p53(R172H) Zellen in-vivo und dieser Effekt war unabh&auml;ngig von basalen RhoA-Aktivit&auml;t innerhalb der Zelle K&ouml;rper. Zusammengenommen, quantitative in Vivo illustriert Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung, dass RhoA ist nicht nur notwendig f&uuml;r Invasion, sondern auch subzellulare r&auml;umliche Verordnung RhoA Aktivit&auml;t, im Gegensatz zu ihrer weltweiten T&auml;tigkeit, ist wahrscheinlich zu regieren Einmarsch Effizienz in-vivo. Unsere Ergebnisse zeigen den Nutzen der FLIM-Bund bei der Analyse von dynamischen Biomarker w&auml;hrend medikament&ouml;se Behandlung bei lebenden Tieren, und sie zeigen auch wie diskrete intrazellul&auml;re Molekulare Becken k&ouml;nnte durch zuk&uuml;nftige anti-invasive Therapien differentiell manipuliert werden.

R&auml;umliche Regelung der RhoA T&auml;tigkeit w&auml;hrend Bauchspeicheldr&uuml;senkrebs Zelle Invasion von mutierten p53 getrieben.

Scar tissue formation during healing of extensive skin wounds may be related to delayed reepithelialization, while elevated levels of hyaluronan may suppress scar tissue formation. This study investigates the expression of hyaluronan by human skin fibroblasts in response to keratinocyte-conditioned medium (KCM), and attempts to identify any active factors within the conditioned medium. Serum-free KCM was assessed for its ability to stimulate the incorporation of (3) H-glucosamine into fibroblast glycosaminoglycans, and hyaluronan synthesis. Conditioned medium was concentrated with an ultrafiltration membrane with a 30 kDa cutoff. Stratifin was assessed for its ability to stimulate hyaluronan synthesis and its role in KCM. KCM stimulated fibroblast glycosaminoglycan synthesis up to a 3.3-fold increase and a 6.5-fold increase in hyaluronan synthesis compared with serum-free controls. Preliminary characterization of the active factors showed that they are retained by a >30 kDa ultrafiltration membrane, and are protease sensitive and heat resistant. Emmprin and stratifin were shown to stimulate fibroblast hyaluronan synthesis, and the hyaluronan-stimulating activity of KCM was removed following stratifin depletion and to a lesser extent by emmprin depletion. Keratinocytes release soluble factors, including stratifin, that stimulate fibroblast hyaluronan synthesis, and this stimulation of fibroblast hyaluronan may contribute to the suppression of scar tissue formation.

Keratinocytes stimulate fibroblast hyaluronan synthesis through the release of stratifin: a possible role in the suppression of scar tissue formation.

Narbengewebe Bildung bei der Heilung von Wunden umfangreiche Haut kann zu verz&ouml;gerten Reepithelialization zusammenh&auml;ngen, w&auml;hrend erh&ouml;hte Konzentrationen von Hyaluronan Narbengewebe Bildung unterdr&uuml;cken k&ouml;nnen. Diese Studie untersucht den Ausdruck der Hyalurons&auml;ure bei den menschlichen Fibroblasten als Reaktion auf Keratinozyten konditionierten Medium (KCM), und versucht, alle aktiven Faktoren im konditionierten Medium zu identifizieren. Serumfreie KCM wurde f&uuml;r seine F&auml;higkeit, die Aufnahme (3) H-Glucosamin in Fibroblasten Glycosaminoglycans und Hyalurons&auml;ure-Synthese anregen bewertet. Konditionierten Medium konzentrierte sich mit einer Membran Ultrafiltration mit einer Grenzfrequenz von 30 kDa. Stratifin wurde f&uuml;r seine F&auml;higkeit zur F&ouml;rderung von Hyalurons&auml;ure-Synthese und ihre Rolle im KCM bewertet. KCM stimuliert Fibroblasten Glykosaminoglykane Synthese bis zu einer Erh&ouml;hung um 3.3-fold und 6.5-fold gegen&uuml;ber serumfreie Steuerelemente Hyalurons&auml;ure-Synthese. Vorl&auml;ufige Charakterisierung der aktiven Faktoren zeigte, dass sie, indem beibehalten werden ein &gt; 30 kDa-Ultrafiltration-Membran, und Protease sind, empfindlich und hitzebest&auml;ndig. Emmprin und Stratifin Fibroblasten Hyaluronan Synthese stimulieren gezeigt, und die Hyalurons&auml;ure-stimulierenden Aktivit&auml;t kcm entfernt wurde nach Stratifin Ersch&ouml;pfung und in geringerem Ma&szlig;e von Emmprin Ersch&ouml;pfung. Keratinozyten lassen l&ouml;sliche Faktoren, einschlie&szlig;lich Stratifin, die Hyalurons&auml;ure-Synthese von Fibroblasten zu stimulieren, und diese Stimulation der Fibroblasten Hyaluronan kann dazu beitragen, die Unterdr&uuml;ckung der Bildung von Narbengewebe.

Keratinozyten stimulieren Fibroblasten Hyalurons&auml;ure-Synthese durch die Freigabe von Stratifin: eine m&ouml;gliche Rolle bei der Unterdr&uuml;ckung der Bildung von Narbengewebe.

Article	Year
Effect of different classes of gadolinium-based contrast agents on control and nephrogenic systemic fibrosis-derived fibroblast proliferation. Radiology\| PubMed ID: 20663970	2010
PTEN loss promotes rasHa-mediated papillomatogenesis via dual up-regulation of AKT activity and cell cycle deregulation but malignant conversion proceeds via PTEN-associated pathways. Cancer research\| PubMed ID: 16452183	2006
Fos cooperation with PTEN loss elicits keratoacanthoma not carcinoma, owing to p53/p21 WAF-induced differentiation triggered by GSK3beta inactivation and reduced AKT activity. Journal of cell science\| PubMed ID: 18445683	2008
Spatial regulation of RhoA activity during pancreatic cancer cell invasion driven by mutant p53. Cancer research\| PubMed ID: 21266354	2011
Keratinocytes stimulate fibroblast hyaluronan synthesis through the release of stratifin: a possible role in the suppression of scar tissue formation. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society\| PubMed ID: 21518083	2011

Jean A. Quinn

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