quantitation-analysis-formation-ho-endonuclease-stimulated

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in <em>Saccharomyces cerevisiae</em>

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

Chromosomal translocations are a primary biological response to ionizing radiation (IR) exposure, and are likely to result from the inappropriate repair of the DNA double-strand breaks (DSBs) that are created. An abundance of repetitive sequences in eukaryotic genomes provides ample opportunity for such breaks to be repaired by homologous recombination (HR) between non-allelic repeats. Interestingly, in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae the central strand exchange protein, Rad51 that is required for DSB repair by gene conversion between unlinked repeats that conserves genomic structure also suppresses translocation formation by several HR mechanisms. In particular, Rad51 suppresses translocation formation by single-strand annealing (SSA), perhaps the most efficient mechanism for translocation formation by HR in both yeast and mammalian cells. Further, the enhanced translocation formation that emerges in the absence of Rad51 displays a distinct pattern of genetic control, suggesting that this occurs by a separate mechanism. Since hypomorphic mutations in RAD51 in mammalian cells also reduce DSB repair by conservative gene conversion and stimulate non-conservative repair by SSA, this mechanism may also operate in humans and, perhaps contribute to the genome instability that propels the development of cancer.

Rad51 inhibits translocation formation by non-conservative homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae.

Chromosomale Translokationen sind eine prim&auml;re biologische Reaktion auf ionisierende Strahlung (IR), und wahrscheinlich das Ergebnis der unangemessenen Reparatur von Br&uuml;chen der DNA-Doppel-Strang (DSBs), die erstellt werden. Eine F&uuml;lle von sich wiederholenden Sequenzen in eukaryotischen Genomen bietet reichlich Gelegenheit f&uuml;r solche Unterbrechungen durch homologe Rekombination (HR) zwischen nicht-Allele repariert werden wiederholt. Rad51, die ist erforderlich f&uuml;r DSB-Reparatur durch Gen-Konvertierung zwischen unverkn&uuml;pfte wiederholt, die genomische Struktur spart unterdr&uuml;ckt Interessanterweise in der Backhefe, die zentralen Strang-Austausch-Protein, auch Translokation Bildung von verschiedenen HR-Mechanismen. Insbesondere unterdr&uuml;ckt Rad51 Translokation Bildung durch Single-Strand Gl&uuml;hen (SSA), vielleicht den wirksamste Mechanismus f&uuml;r Translokation Bildung von HR in Hefe und S&auml;ugetierzellen. Dar&uuml;ber hinaus zeigt die verst&auml;rkten Translokation-Formation, die in Ermangelung Rad51 entsteht ein bestimmtes Muster der genetischen Kontrolle, was darauf hindeutet, dass in diesem durch einen separaten Mechanismus Fall. Da hypomorphen Mutationen im RAD51 in den S&auml;ugetier-Zellen auch DSB-Reparatur von konservativen gen Konvertierung verringern sowie nicht-konservative Reparatur durch SSA zu f&ouml;rdern, kann diesen Mechanismus auch beim Menschen betreiben und vielleicht zum Genom Instabilit&auml;t, die treibt die Entwicklung von Krebs beitragen.

RAD51 hemmt Translokation Bildung von nicht-konservative homologe Rekombination in Saccharomyces Cerevisiae.

BRCA1 und BRCA2 sind die bekanntesten Brustkrebs-Suszeptibilit&auml;t Gene. Zus&auml;tzliche Gene, DNA-Reparatur beteiligt wurden als pr&auml;disponierenden Brustkrebs festgestellt. Ein solches gen, RAD51C, ist essentiell f&uuml;r homologe Rekombination Reparatur. Mehrere wahrscheinlich pathogene RAD51C-Mutationen wurden in BRCA1 - und BRCA2-negativ Brust- und Eierstockkrebs Familien identifiziert. Wir spielten die vollst&auml;ndige Sequenzierung des RAD51C in Germline DNA von 286 weiblichen Brust und/oder Eierstockkrebs F&auml;lle mit einer Familiengeschichte von Brust- und Eierstockkrebs, die zuvor f&uuml;r Mutationen im BRCA1- und BRCA2 negativ getestet hatte. Wir geschirmt 133 Brustkrebsf&auml;lle, 119 Eierstockkrebs F&auml;lle und 34 mit Brust- und Eierstockkrebs. F&uuml;nfzehn DNA-Sequenz-Varianten wurden identifiziert; einschlie&szlig;lich vier verband intronic, 5&#39; UTR, einem Projekttr&auml;ger, drei Synonym und sechs nicht Synonym Varianten. Keine abgeschnitten wurden. Die in-Silico-SIFT und Polyphen-Programme wurden verwendet, um m&ouml;glichen Pathogenit&auml;t der sechs nicht-gleich-Varianten basierend auf Sequenz Erhaltung vorherzusagen. G153D und T287A wurden vorhergesagt werden pathogenen. Zwei weitere Varianten, A126T und R214C ver&auml;ndern Aminos&auml;uren in wichtigen Bereichen des Proteins so, dass sie Krankheitserreger sein k&ouml;nnten. Zwei-Hybrid-Screening und Immunoblot-Analysen wurden durchgef&uuml;hrt, um die Funktionalit&auml;t dieser vier nicht-gleich-Varianten in der Hefe zu beurteilen. Das RAD51C-G153D-Protein angezeigt keine nachweisbaren Interaktion mit entweder XRCC3 oder RAD51B und RAD51C-R214C angezeigt deutlich zur&uuml;ckging Interaktion mit XRCC3 und RAD51B (p &lt; 0,001). Immunoblots RAD51C-Gal4 Aktivierung Dom&auml;ne Fusion Peptide zeigte Protein-Ebene von RAD51C-G153D und RAD51C-R214C, die 50 % und 60 % der den Wildtyp, beziehungsweise. Auf der Grundlage dieser Daten ist die RAD51C-G153D-Variante wahrscheinlich pathogenen, w&auml;hrend die RAD51C - R214C-Variante hypomorphen der unsicheren Pathogenit&auml;t ist. Diese Ergebnisse liefern weitere Unterst&uuml;tzung, RAD51C ist eine seltene Brust- und Eierstockkrebs Anf&auml;lligkeit gen.

RAD51C Keimbahn-Mutationen im Brust- und Eierstockkrebs F&auml;lle aus Familien mit hohem Risiko.

BRCA1 and BRCA2 are the most well-known breast cancer susceptibility genes. Additional genes involved in DNA repair have been identified as predisposing to breast cancer. One such gene, RAD51C, is essential for homologous recombination repair. Several likely pathogenic RAD51C mutations have been identified in BRCA1- and BRCA2-negative breast and ovarian cancer families. We performed complete sequencing of RAD51C in germline DNA of 286 female breast and/or ovarian cancer cases with a family history of breast and ovarian cancers, who had previously tested negative for mutations in BRCA1 and BRCA2. We screened 133 breast cancer cases, 119 ovarian cancer cases, and 34 with both breast and ovarian cancers. Fifteen DNA sequence variants were identified; including four intronic, one 5' UTR, one promoter, three synonymous, and six non-synonymous variants. None were truncating. The in-silico SIFT and Polyphen programs were used to predict possible pathogenicity of the six non-synonomous variants based on sequence conservation. G153D and T287A were predicted to be likely pathogenic. Two additional variants, A126T and R214C alter amino acids in important domains of the protein such that they could be pathogenic. Two-hybrid screening and immunoblot analyses were performed to assess the functionality of these four non-synonomous variants in yeast. The RAD51C-G153D protein displayed no detectable interaction with either XRCC3 or RAD51B, and RAD51C-R214C displayed significantly decreased interaction with both XRCC3 and RAD51B (p<0.001). Immunoblots of RAD51C-Gal4 activation domain fusion peptides showed protein levels of RAD51C-G153D and RAD51C-R214C that were 50% and 60% of the wild-type, respectively. Based on these data, the RAD51C-G153D variant is likely to be pathogenic, while the RAD51C- R214C variant is hypomorphic of uncertain pathogenicity. These results provide further support that RAD51C is a rare breast and ovarian cancer susceptibility gene.

RAD51C germline mutations in breast and ovarian cancer cases from high-risk families.

In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, null alleles of several DNA repair and recombination genes confer defects in recombination that grow more severe with decreasing sequence length, indicating that they are required for short-sequence recombination (SSR). RAD1 and RAD10, which encode the subunits of the structure-specific endonuclease Rad1/10, are critical for SSR. MRE11, RAD50, and XRS2, which encode the subunits of M/R/X, another complex with nuclease activity, are also crucially important. Genetic evidence suggests that Rad1/10 and M/R/X act on the same class of substrates during SSR. MSH2 and MSH3, which encode subunits of Msh2/3, a complex active during mismatch repair and recombination, are also important for SSR but play a more restricted role. Additional evidence suggests that SSR is distinct from nonhomologous end joining and is superimposed upon basal homologous recombination.

Multiple pathways promote short-sequence recombination in Saccharomyces cerevisiae.

Mehrere Wege f&#xF6;rdern kurz-Sequenz Rekombination in Saccharomyces cerevisiae.

Nucleotide excision repair (NER) is one of several DNA repair pathways that are universal throughout phylogeny. NER has a broad substrate specificity and is capable of removing several classes of lesions to the DNA, including those that accumulate upon exposure to UV radiation. The loss of this activity in NER-defective mutants gives rise to characteristic sensitivities to UV that, in humans, is manifested as a greatly elevated sensitivity to exposure to the sun. Xeroderma pigmentosum (XP), Cockaynes syndrome (CS), and trichothiodystrophy (TTD) are three, rare, recessively inherited human diseases that are linked to these defects. Interestingly, some of the symptoms in afflicted individuals appear to be due to defects in transcription, the result of the dual functionality of several components of the NER apparatus as parts of transcription factor IIH (TFIIH). Studies with several model systems have revealed that the genetic and biochemical features of NER are extraordinarily conserved in eukaryotes. One system that has been studied very closely is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. While many yeast NER mutants display the expected increases in UV sensitivity and defective transcription, other interesting phenotypes have also been observed. Elevated mutation and recombination rates, as well as increased frequencies of genome rearrangement by retrotransposon movement and recombination between short genomic sequences have been documented. The potential relevance of these novel phenotypes to disease in humans is discussed.

Nucleotide Excision Repair, Genome Stability, and Human Disease: New Insight from Model Systems.

Nukleotidexzisionsreparatur, die Stabilit&#xE4;t des Genoms, and Human Disease: New Insight von Modellsystemen.

DNA-Fragment Transplacement in Saccharomyces cerevisiae: einige genetische &#xDC;berlegungen.

The ability to make specific genomic alterations is an invaluable tool to researchers who use genetics and biochemistry to study problems in biology. We have investigated some of the parameters governing DNA fragment transplacement in two commonly used strains of Saccharomyces cerevisiae, S288C and W303-1A. These strains exhibited a marked difference in their capacity to take up plasmid DNA and utilize linear DNA fragments as substrates for transplacement. The contributions of transformation efficiency, length of homology, and alternative target site configuration were assessed. This analysis indicates that several genetic parameters are important for optimizing the efficiency of gene transplacement.

DNA fragment transplacement in Saccharomyces cerevisiae: some genetic considerations.

Using a model system, we have shown that replicative senescence is accompanied by a 16-fold increase in base substitution and frameshift mutations near a chromosome end. The increase was dependent on error-prone polymerases required for the mutagenic response to DNA lesions that block the replication fork.

Telomere dysfunction drives increased mutation by error-prone polymerases Rev1 and zeta in Saccharomyces cerevisiae.

Mit einem Modellsystem haben wir gezeigt, dass Zellalterung durch eine versechzehnfacht und produziert base Substitution und Frameshift-Mutationen in der N&auml;he ein Chromosom Ende begleitet wird. Der Anstieg ist abh&auml;ngig von fehleranf&auml;lligen Polymerasen ben&ouml;tigt f&uuml;r die Mutagene Antwort auf DNA-L&auml;sionen, die der Wiederholunggabel zu blockieren.

Telomer-Dysfunktion Laufwerke erh&ouml;hte Mutation von fehleranf&auml;lligen Polymerasen Rev1 und Zeta in Saccharomyces Cerevisiae.

Increased mitotic recombination enhances the risk for loss of heterozygosity, which contributes to the generation of cancer in humans. Defective DNA replication can result in elevated levels of recombination as well as mutagenesis and chromosome loss. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, a null allele of the RAD27 gene, which encodes a structure-specific nuclease involved in Okazaki fragment processing, stimulates mutation and homologous recombination. Similarly, rad3-102, an allele of the gene RAD3, which encodes an essential helicase subunit of the core TFIIH transcription initiation and DNA repairosome complexes confers a hyper-recombinagenic and hypermutagenic phenotype. Combining the rad27 null allele with rad3-102 dramatically stimulated interhomolog recombination and chromosome loss but did not affect unequal sister-chromatid recombination, direct-repeat recombination, or mutation. Interestingly, the percentage of cells with Rad52-YFP foci also increased in the double-mutant haploids, suggesting that rad3-102 may increase lesions that elicit a response by the recombination machinery or, alternatively, stabilize recombinagenic lesions generated by DNA replication failure. This net increase in lesions led to a synthetic growth defect in haploids that is relieved in diploids, consistent with rad3-102 stimulating the generation and rescue of collapsed replication forks by recombination between homologs.

A mutant allele of the transcription factor IIH helicase gene, RAD3, promotes loss of heterozygosity in response to a DNA replication defect in Saccharomyces cerevisiae.

Erh&ouml;hte Mitotische Rekombination erh&ouml;ht das Risiko f&uuml;r Verlust der Heterozygotie, und tr&auml;gt so zur Generation der Krebs beim Menschen. Defekte DNA-Replikation kann erh&ouml;hte Konzentrationen von Rekombination sowie Mutagenese und Chromosom Verlust f&uuml;hren. In der Hefe Saccharomyces Cerevisiae eine null-Allel im RAD27-gen, das eine Struktur-Spezifische Nuklease codiert Okazaki Fragment Verarbeitung beteiligt, stimuliert, Mutation und Homologe Rekombination. Ebenso rad3-102, verleiht ein Allel des Gens RAD3, das eine wesentliche Helicase-Untereinheit der Kern TFIIH Transkription Einleitung und DNA-Repairosome-komplexe codiert einen hyper-Recombinagenic und Hypermutagenic-Ph&auml;notyp. Kombination der rad27-null-Allel mit rad3-102 drastisch stimuliert interhomolog Rekombination und Chromosom Verlust aber hatte keine Auswirkungen auf die ungleiche Schwester Chromatid Rekombination, direkt-Wiederholung Rekombination oder Mutation. Interessant ist, stieg der Anteil der Zellen mit Rad52-YFP Herde auch in der Doppel-Mutant-Haploids, was darauf hindeutet, dass rad3-102 L&auml;sionen erh&ouml;hen kann, die eine Antwort zu entlocken, der Rekombination-Maschine oder, alternativ stabilisieren Recombinagenic L&auml;sionen von DNA Replikationsfehler generiert. Diese Nettozunahme der L&auml;sionen f&uuml;hrte zu einen synthetischen Wachstum-Defekt im Haploids, die in lassen, mit rad3-102 F&ouml;rderung der Erzeugung und der Rettung der reduzierten Replikation Gabeln durch Rekombination zwischen UCP1 entlastet wird.

Ein mutant Allel Transkription Faktor IIH Helicase gen RAD3, f&ouml;rdert Verlust der Heterozygotie als Reaktion auf einen DNA-Replikation-Defekt in Saccharomyces Cerevisiae.

Exposure to ionizing radiation results in a variety of genome rearrangements that have been linked to tumor formation. Many of these rearrangements are thought to arise from the repair of double-strand breaks (DSBs) by several mechanisms, including homologous recombination (HR) between repetitive sequences dispersed throughout the genome. Doses of radiation sufficient to create DSBs in or near multiple repetitive elements simultaneously could initiate single-strand annealing (SSA), a highly efficient, though mutagenic, mode of DSB repair. We have investigated the genetic control of the formation of translocations that occur spontaneously and those that form after the generation of DSBs adjacent to homologous sequences on two, non-homologous chromosomes in Saccharomyces cerevisiae. We found that mutations in a variety of DNA repair genes have distinct effects on break-stimulated translocation. Furthermore, the genetic requirements for repair using 300bp and 60bp recombination substrates were different, suggesting that the SSA apparatus may be altered in response to changing substrate lengths. Notably, RAD59 was found to play a particularly significant role in recombination between the short substrates that was partially independent of that of RAD52. The high frequency of these events suggests that SSA may be an important mechanism of genome rearrangement following acute radiation exposure.

RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae.

Exposition gegen&uuml;ber ionisierender Strahlung f&uuml;hrt zu einer Vielzahl von Genom-Umlagerungen, die zur Tumorbildung verkn&uuml;pft wurden. Viele von diesen Umlagerungen werden gedacht, um aus der Reparatur von Br&uuml;chen Doppel-Str&auml;nge (DSBs) ergeben, durch mehrere Mechanismen, einschlie&szlig;lich homologe Rekombination (HR) zwischen repetitive Sequenzen, die das Genom verstreut. Strahlendosen ausreichend DSBs gleichzeitig in oder in der N&auml;he mehrere sich wiederholende Elemente erstellen konnte Single-Strand Gl&uuml;hen (SSA), initiiert einen hocheffizienten, obwohl Mutagene, DSB-Reparatur-Modus. Wir haben untersucht, die genetische Kontrolle der Bildung von Translokationen, die spontan auftreten und solche, die nach der Generierung von DSBs neben homologe Sequenzen auf zwei, nicht-homologe Chromosomen in Saccharomyces Cerevisiae zu bilden. Wir fanden, dass Mutationen in einer Vielzahl von DNA-Reparatur-Gene unterschiedliche Auswirkungen auf die Pause-stimuliert Translokation haben. Dar&uuml;ber hinaus die genetischen Voraussetzungen f&uuml;r Reparatur mit 300bp und 60bp Rekombination Substrate waren unterschiedlich, was darauf hindeutet, dass der SSA-Apparat in sich ver&auml;ndernden Substrat L&auml;ngen ver&auml;ndert werden kann. RAD59 fand sich insbesondere bei Rekombination zwischen den kurzen Substrate, die teilweise unabh&auml;ngig von jenem des RAD52 war eine besonders wichtige Rolle zu spielen. Die hohe Frequenz der diese Ereignisse legt nahe, dass SSA ein wichtiger Mechanismus der Genom-Umlagerung nach akuten Strahlenbelastung sein kann.

RAD59 ist erforderlich f&uuml;r effiziente Reparatur von gleichzeitigen Doppel-Strang-Br&uuml;chen, was zu Translokationen in Saccharomyces Cerevisiae.

As we age, the majority of our cells gradually lose the capacity to divide because of replicative senescence that results from the inability to replicate the ends of chromosomes. The timing of senescence is dependent on the length of telomeric DNA, which elicits a checkpoint signal when critically short. Critically short telomeres also become vulnerable to deleterious rearrangements, end-degradation and telomere-telomere fusions. Here we report a novel role of non-homologous end-joining (NHEJ), a pathway of double-strand break repair in influencing both the kinetics of replicative senescence and the rate of chromosome loss in telomerase-deficient Saccharomyces cerevisiae. In telomerase-deficient cells, the absence of NHEJ delays replicative senescence, decreases loss of viability during senescence, and suppresses senescence-associated chromosome loss and telomere-telomere fusion. Differences in mating-type gene expression in haploid and diploid cells affect NHEJ function, resulting in distinct kinetics of replicative senescence. These results suggest that the differences in the kinetics of replicative senescence in haploid and diploid telomerase-deficient yeast are determined by changes in NHEJ-dependent telomere fusion, perhaps through the initiation of the breakage-fusion-bridge cycle.

Mating type influences chromosome loss and replicative senescence in telomerase-deficient budding yeast by Dnl4-dependent telomere fusion.

Wenn wir &auml;lter werden, verlieren die meisten unserer Zellen allm&auml;hlich die F&auml;higkeit, wegen der Zellalterung zu unterteilen, die sich aus der Unf&auml;higkeit, die Enden der Chromosomen zu replizieren. Das Timing der Seneszenz ist abh&auml;ngig von der L&auml;nge der Telomerisches DNA und ein Pr&uuml;fpunkt Signal wenn kritisch kurz entlockt. Kritisch kurze Telomere auch anf&auml;llig f&uuml;r sch&auml;dliche Umlagerungen, End-Abbau und Telomer-Telomer-Fusionen. Hier berichten wir eine neuartige Rolle nicht-homologe Ende-verbinden (NHEJ), ein Weg der Doppel-Strang Pause Reparatur beeinflussen sowohl die Kinetik der Zellalterung und die Rate der Chromosom-Verlust in der Telomerase-defizienten Saccharomyces Cerevisiae. In Telomerase-defizienten Zellen das Fehlen von NHEJ verz&ouml;gert die Zellalterung verringert Verlust der Lebensf&auml;higkeit w&auml;hrend Seneszenz und unterdr&uuml;ckt die Seneszenz-assoziierte Chromosom-Verlust und Telomer-Telomer-Fusion. Unterschiede in der Paarung-Typ Genexpression in haploide und diploide Zellen beeinflussen NHEJ-Funktion, wodurch unterschiedliche Kinetik der Zellalterung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Unterschiede in der Kinetik der Zellalterung in haploide und diploide Telomerase-defizienten Hefe durch &Auml;nderungen in NHEJ-abh&auml;ngige Telomer Fusion, vielleicht durch die Einleitung der Bruch-Fusion-Br&uuml;cke-Zyklus bestimmt sind.

Paarung Typ beeinflusst das Chromosom Verlust und Zellalterung in der Telomerase-defizienten Knospen Hefe von Dnl4-abh&auml;ngige Telomer-Fusion.

Defective DNA replication can result in substantial increases in the level of genome instability. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the pol3-t allele confers a defect in the catalytic subunit of replicative DNA polymerase delta that results in increased rates of mutagenesis, recombination, and chromosome loss, perhaps by increasing the rate of replicative polymerase failure. The translesion polymerases Pol eta, Pol zeta, and Rev1 are part of a suite of factors in yeast that can act at sites of replicative polymerase failure. While mutants defective in the translesion polymerases alone displayed few defects, loss of Rev1 was found to suppress the increased rates of spontaneous mutation, recombination, and chromosome loss observed in pol3-t mutants. These results suggest that Rev1 may be involved in facilitating mutagenic and recombinagenic responses to the failure of Pol delta. Genome stability, therefore, may reflect a dynamic relationship between primary and auxiliary DNA polymerases.

Mutagenic and recombinagenic responses to defective DNA polymerase delta are facilitated by the Rev1 protein in pol3-t mutants of Saccharomyces cerevisiae.

Defekte DNA-Replikation kann deutliche Steigerung des Niveaus der Genom Instabilit&auml;t f&uuml;hren. In der Hefe Saccharomyces Cerevisiae verleiht der pol3-t-Allel defekt die katalytische Untereinheit der replicative DNA-Polymerase-Delta, die erh&ouml;hte Preise Mutagenese, Rekombination und Chromosom Verlust, vielleicht f&uuml;hrt durch die replicative Polymerase Fehler erh&ouml;ht. Des Translesion Polymerasen Pol Eta und Pol Zeta Rev1 sind Teil einer Reihe von Faktoren in der Hefe, die an den Standorten replicative Polymerase Versagen handeln kann. W&auml;hrend Mutanten Defekt in der Translesion Polymerasen allein einige defekte angezeigt, wurde Verlust von Rev1 gefunden, um die erh&ouml;hten Raten von spontanen Mutation, Rekombination und Chromosom Verlust beobachtet in pol3-t-Mutanten zu unterdr&uuml;cken. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Rev1 Erleichterung mutagen und Recombinagenic Reaktionen auf das Scheitern der Pol Delta beteiligt sein k&ouml;nnen. Genomstabilit&auml;t, kann also eine dynamische Beziehung zwischen prim&auml;ren und Hilfsstoffe DNA-Polymerasen wider.

Mutagen und Recombinagenic Reaktionen auf defekte DNA-Polymerase Delta werden durch das Rev1-Protein in pol3-t-Mutanten von Saccharomyces Cerevisiae erleichtert.

Telomerase is a ribonucleoprotein complex required for the replication and protection of telomeric DNA in eukaryotes. Cells lacking telomerase undergo a progressive loss of telomeric DNA that results in loss of viability and a concomitant increase in genome instability. We have used budding yeast to investigate the relationship between telomerase deficiency and the generation of chromosomal translocations, a common characteristic of cancer cells. Telomerase deficiency increased the rate of formation of spontaneous translocations by homologous recombination involving telomere proximal sequences during crisis. However, telomerase deficiency also decreased the frequency of translocation formation following multiple HO-endonuclease catalyzed DNA double-strand breaks at telomere proximal or distal sequences before, during and after crisis. This decrease correlated with a sequestration of the central homologous recombination factor, Rad52, to telomeres determined by chromatin immuno-precipitation. This suggests that telomerase deficiency results in the sequestration of Rad52 to telomeres, limiting the capacity of the cell to repair double-strand breaks throughout the genome. Increased spontaneous translocation formation in telomerase-deficient yeast cells undergoing crisis is consistent with the increased incidence of cancer in elderly humans, as the majority of our cells lack telomerase. Decreased translocation formation by recombinational repair of double-strand breaks in telomerase-deficient yeast suggests that the reemergence of telomerase expression observed in many human tumors may further stimulate genome rearrangement. Thus, telomerase may exert a substantial effect on global genome stability, which may bear significantly on the appearance and progression of cancer in humans.

Telomerase deficiency affects the formation of chromosomal translocations by homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae.

Telomerase ist ein Ribonucleoprotein Komplex ben&ouml;tigt, die f&uuml;r die Replikation und den Schutz der Telomerisches DNA in den Eukaryotes. Zellen Telomerase fehlt durchmachen einen progressiven Verlust des Telomerisches DNA, die Verlust der Lebensf&auml;higkeit und eine damit einhergehende Zunahme der Genom Instabilit&auml;t f&uuml;hrt. Wir haben angehende Hefe verwendet, um die Beziehung zwischen Telomerase-Mangel und die Generierung von chromosomalen Translokationen, ein gemeinsames Merkmal der Krebszellen zu untersuchen. Telomerase-Mangel erh&ouml;ht die Rate der Bildung der spontane Umsiedlung durch homologe Rekombination mit proximalen Telomer-Sequenzen bei der Krise. Telomerase-Mangel sank jedoch, auch die H&auml;ufigkeit der Translokation katalysierte Bildung nach mehreren HO-Endonuklease DNA-Doppel-Strang-Breaks im Telomer-proximalen und distalen-Sequenzen vor, w&auml;hrend und nach der Krise. Dieser R&uuml;ckgang korrelierte mit einer Beschlagnahme von der zentralen homologe Rekombination Faktor, Rad52, Telomere durch Chromatin Immuno-Niederschlag bestimmt. Dies deutet darauf hin, dass die Beschlagnahme von Rad52 Telomerase-Mangel an Telomere, Begrenzung der Kapazit&auml;t der Zelle, Doppel-Strang Pausen w&auml;hrend des Genoms zu reparieren bringt. Erh&ouml;hte spontane Umsiedlung-Formation in Telomerase-defizienten Hefezellen in der Krise steht im Einklang mit dem erh&ouml;hten Auftreten von Krebs bei &auml;lteren Menschen, da die Mehrheit unserer Zellen Telomerase fehlt. Verminderte Translokation Bildung von recombinational Reparatur von Br&uuml;chen in der Telomerase-defizienten Hefe Doppel-Str&auml;nge schl&auml;gt vor, dass das Wiederauftauchen von Telomerase Ausdruck in vielen menschlichen Tumoren beobachtet globalen Ebene weitere Genom-Umlagerung anregen kann. Telomerase kann so erheblichen Auswirkungen auf globale Genomstabilit&auml;t aus&uuml;ben, welche deutlich auf das Erscheinungsbild und die Progression von Krebs beim Menschen tragen kann.

Telomerase-Mangel wirkt sich auf die Bildung von chromosomalen Translokationen durch homologe Rekombination in Saccharomyces Cerevisiae.

Chromosomal translocations are frequently observed in cells exposed to agents that cause DNA double-strand breaks (DSBs), such as ionizing radiation and chemotherapeutic drugs, and are often associated with tumors in mammals. Recently, translocation formation in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been found to occur at high frequencies following the creation of multiple DSBs adjacent to repetitive sequences on non-homologous chromosomes. The genetic control of translocation formation and the chromosome complements of the clones that contain translocations suggest that translocation formation occurs by single-strand annealing (SSA). Among the factors important for translocation formation by SSA is the central mismatch repair (MMR) and homologous recombination (HR) factor, Msh2. Here we describe the effects of several msh2 missense mutations on translocation formation that suggest that Msh2 has separable functions in stabilizing annealed single strands, and removing non-homologous sequences from their ends. Additionally, interactions between the msh2 alleles and a null allele of RAD1, which encodes a subunit of a nuclease critical for the removal of non-homologous tails suggest that Msh2 blocks an alternative mechanism for removing these sequences. These results suggest that Msh2 plays multiple roles in the formation of chromosomal translocations following acute levels of DNA damage.

Msh2 blocks an alternative mechanism for non-homologous tail removal during single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.

Chromosomale Translokationen werden h&auml;ufig beobachtet, in Zellen, die Agents, die DNA-Doppel-Strang-Pausen (DSBs), wie ionisierende Strahlung und Chemotherapeutika verursachen und sind oft verbunden mit Tumoren bei S&auml;ugetieren ausgesetzt. Vor kurzem wurde die Translokation-Formation in der Backhefe, gefunden, bei hohen Frequenzen, die nach der Gr&uuml;ndung mehrere DSBs neben repetitive Sequenzen auf nicht-homologe Chromosomen auftreten. Die genetische Kontrolle der Translokation-Formation und der Chromosom-Erg&auml;nzungen der Klone, die Umsiedlung enthalten zufolge Translokation Bildung durch Single-Strand Gl&uuml;hen (SSA) auftritt. Zu den Faktoren, die wichtig f&uuml;r die Bildung der Translokation von SSA ist die zentrale Fehlanpassung Reparatur (MMR) und Homologe Rekombination (HR)-Faktor, Msh2. Hier beschreiben wir die Auswirkungen der verschiedenen msh2 Missense-Mutationen Translokation-Formation, denen zufolge Msh2 trennbare Funktionen im gegl&uuml;hten einzelne Str&auml;nge zu stabilisieren und Entfernen von nicht-homologe Sequenzen aus ihren Enden hat. Interaktionen zwischen den Allelen msh2 und eine null-Allel RAD1, das eine Untereinheit des eine Nuklease kritisch f&uuml;r die Beseitigung von nicht-homologe Tails codiert empfehlen zus&auml;tzlich Msh2 einen alternativen Mechanismus f&uuml;r das Entfernen dieser Sequenzen blockiert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Msh2 spielt mehrere Rollen bei der Bildung der chromosomalen Translokationen nach akute Ebenen von DNA-Sch&auml;den.

Msh2 blockiert einen alternativen Mechanismus f&uuml;r nicht-homologe Schwanz Entfernung w&auml;hrend Single-Strand Gl&uuml;hen in Saccharomyces Cerevisiae.

Studies in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, have demonstrated that a substantial fraction of double-strand break repair following acute radiation exposure involves homologous recombination between repetitive genomic elements. We have previously described an assay in S. cerevisiae that allows us to model how repair of multiple breaks leads to the formation of chromosomal translocations by single-strand annealing (SSA) and found that Rad59, a paralog of the single-stranded DNA annealing protein Rad52, is critically important in this process. We have constructed several rad59 missense alleles to study its function more closely. Characterization of these mutants revealed proportional defects in both translocation formation and spontaneous direct-repeat recombination, which is also thought to occur by SSA. Combining the rad59 missense alleles with a null allele of RAD1, which encodes a subunit of a nuclease required for the removal of non-homologous tails from annealed intermediates, substantially suppressed the low frequency of translocations observed in rad1-null single mutants. These data suggest that at least one role of Rad59 in translocation formation by SSA is supporting the machinery required for cleavage of non-homologous tails.

RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.

Studien in der Backhefe, haben bewiesen, dass ein wesentlicher Teil der Doppel-Strang Pause Reparatur nach akuten Strahlenbelastung homologe Rekombination zwischen den sich wiederholenden genomische Elemente beinhaltet. Wir haben zuvor ein Assay in S. Cerevisiae beschrieben, die uns zu modellieren, wie Reparatur von mehreren Br&uuml;chen f&uuml;hrt zu der Bildung von chromosomalen Translokationen durch Single-Strand Gl&uuml;hen (SSA) und festgestellt, dass Rad59, eine Paralog der einzeln-angeschwemmte DNA Protein Rad52, Gl&uuml;hen entscheidender Bedeutung in diesem Prozess ist erlaubt. Wir haben mehrere rad59 Missense-Allele um seine Funktion genauer studieren errichtet. Charakterisierung von diese Mutanten offenbart proportional M&auml;ngel in Translokation Bildung und spontane direkt-Wiederholung-Rekombination, die auch gedacht wird, Auftreten von SSA. Kombination der Allele Missense rad59 mit einem null-Allel RAD1, das eine Untereinheit des eine Nuklease ben&ouml;tigt, f&uuml;r die Beseitigung von nicht-homologe Schw&auml;nze aus gegl&uuml;htem Zwischenprodukte codiert, unterdr&uuml;ckt wesentlich die Niederfrequenz der Umsiedlung in rad1-Null einzigen Mutanten zu beobachten. Diese Daten legen nahe, dass mindestens eine Rolle von Rad59 in Translokation unterst&uuml;tzt Bildung von SSA die Maschinen, die f&uuml;r die Spaltung der nicht-homologe Schw&auml;nze n&ouml;tig.

Article	Year
Rad51 inhibits translocation formation by non-conservative homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae. PloS one\| PubMed ID: 20686691	2010
RAD51C germline mutations in breast and ovarian cancer cases from high-risk families. PloS one\| PubMed ID: 21980511	2011
Multiple pathways promote short-sequence recombination in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology\| PubMed ID: 12101230	2002
Nucleotide Excision Repair, Genome Stability, and Human Disease: New Insight from Model Systems. Journal of biomedicine & biotechnology\| PubMed ID: 12488584	2002
DNA fragment transplacement in Saccharomyces cerevisiae: some genetic considerations. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 14769961	2004
Telomere dysfunction drives increased mutation by error-prone polymerases Rev1 and zeta in Saccharomyces cerevisiae. Genetics\| PubMed ID: 17151233	2007
A mutant allele of the transcription factor IIH helicase gene, RAD3, promotes loss of heterozygosity in response to a DNA replication defect in Saccharomyces cerevisiae. Genetics\| PubMed ID: 17483411	2007
RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae. DNA repair\| PubMed ID: 18373960	2008
Mating type influences chromosome loss and replicative senescence in telomerase-deficient budding yeast by Dnl4-dependent telomere fusion. Molecular microbiology\| PubMed ID: 18627461	2008
Mutagenic and recombinagenic responses to defective DNA polymerase delta are facilitated by the Rev1 protein in pol3-t mutants of Saccharomyces cerevisiae. Genetics\| PubMed ID: 18711219	2008
Telomerase deficiency affects the formation of chromosomal translocations by homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae. PloS one\| PubMed ID: 18830407	2008
Msh2 blocks an alternative mechanism for non-homologous tail removal during single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae. PloS one\| PubMed ID: 19834615	2009
RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae. Current genetics\| PubMed ID: 20012294	2010

Adam Bailis

Biography

JoVE Journal Publications

Other Publications