culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

The Cl(-) channel blockers, 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid (DIDS) or 4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid (SITS) dose-dependently protected against oxygen-glucose deprivation in cultured rat cortical neurons. DIDS or SITS attenuated oxygen-glucose deprivation-induced increases in extracellular glutamate concentrations and intracellular Ca(2+). DIDS or SITS provided moderate protection against N-methyl-D-aspartate (NMDA) toxicity and decreased NMDA receptor-mediated increases in intracellular Ca(2+). Whole-cell NMDA receptor currents were attenuated 39+/-2% and 21+/-3% by 1 mM DIDS and SITS, respectively. Other Cl(-) channel blockers as equipotent as DIDS and SITS did not decrease oxygen-glucose deprivation- or NMDA-mediated neuronal Ca(2+) influx or toxicity. Neurotoxicity by exogenous glutamate was not prevented by SITS and was exacerbated by DIDS. Reductions in oxygen-glucose deprivation-induced increases in intracellular Ca(2+) levels underlie neuroprotection by DIDS and SITS. This was a reflection of lower extracellular [glutamate], direct inhibition of Ca(2+) influx through postsynaptic NMDA receptors, and possibly through other protective properties associated with DIDS and SITS.

Protection of cortical neurons against oxygen-glucose deprivation and N-methyl-D-aspartate by DIDS and SITS.

Schutz der kortikalen Neuronen gegen Sauerstoff-Glukose-Entzug und N-Methyl-D-Aspartat durch DIDS und sitzt.

Transient exposure of rat cortical cultures to nonlethal oxygen-glucose deprivation (OGD preconditioning) induces tolerance to otherwise lethal oxygen-glucose deprivation (OGD) or N-methyl-D-aspartate 24 h later. This study evaluates the role of cytosolic and mitochondrial Ca2+-dependent cellular signaling. Mechanistic findings are placed in context with other models of ischemic preconditioning or known neurotoxic pathways within cortical neurons. Tolerance to otherwise lethal OGD is suppressed by performing OGD preconditioning in the presence of the broad-scope catalytic antioxidants Mn(III)tetra(4-carboxyphenyl)porphyrin (MnTBAP) or Zn(II)tetra(4-carboxyphenyl)porphyrin [Zn(II)TBAP], but not by a less active analog, Mn(III)tetra(4-sulfonatophenyl)porphyrin, or a potent superoxide scavenger, Mn(III)tetra(N-ethyl-2-pyridyl)porphyrin chloride. Inhibitors of adenosine A1 receptors, nitric oxide synthase, mitogen-activated protein kinase, and poly(ADP-ribose) polymerase fail to suppress OGD preconditioning despite possible links with reactive oxygen species in other models of ischemic preconditioning. Preconditioning is suppressed by 4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid (DIDS), which has been ascribed elsewhere to inhibition of superoxide transport to the cytosol through mitochondrial anion channels. However, although it induces mitochondrial Ca2+ uptake, neuronal preconditioning is largely insensitive to mitochondrial uncoupling with carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone or 2,4-dinitrophenol. Un-couplers will prevent production of mitochondrial reactive oxygen species, implying nonmitochondrial targets by MnTBAP, Zn(II)TBAP, and DIDS. Emphasizing the importance of an increase in cytosolic Ca2+ during preconditioning, a Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitor, KN-62, suppresses development of subsequent tolerance. Summarizing, only those cellular transduction pathways that have the potential to be neurotoxic may be activated by preconditioning in cortical neurons. Finally, a marked decrease in extracellular glutamate is observed during otherwise lethal OGD in preconditioned cultures, suggesting that this end effector may represent a point of convergence across different preconditioning models.

Preconditioning of cortical neurons by oxygen-glucose deprivation: tolerance induction through abbreviated neurotoxic signaling.

Vorkonditionierung der kortikalen Neuronen durch Sauerstoff-Glukose Deprivation: Toleranzinduktion durch neurotoxische abgek&#xFC;rzt Signalisierung.

The growth-arrest-specific protein gas7 is required for morphological differentiation of cultured mouse cerebellar neurons and PC12 cells. Moreover, its overexpression in various cell types induces neurite-like outgrowth. The role of gas7 in neuronal differentiation was further characterized by adenovirus-mediated overexpression in PC12 cells and quantification of the expression of various neuronal markers, in the absence and presence of different concentrations of nerve growth factor (NGF). The potential neuroprotective activity of gas7 against various neurotoxic insults was also assessed. In addition to promoting the formation of neurite-like extensions, overexpression of gas7 potentiated NGF-mediated neuronal differentiation of PC12 cells, as shown by the enhanced expression of the neuronal proteins betaIII-tubulin, synaptotagmin, alpha7 subunit of the acetylcholine receptor, and dihydropyrimidinase related protein-3. This effect was exerted independently of cell cycle progression, as gas7 did not affect proliferation of PC12 cells. While some differentiation enhancers protect PC12 cells against lethal insults, gas7 overexpression in PC12 cells did not protect against oxygen-glucose deprivation, the calcium ionophore A23187, or the nitric oxide donor sodium nitroprusside, suggesting that gas7 is not neuroprotective. The ability of gas7 to potentiate neuronal differentiation makes it a potential therapeutic target to promote re-establishment of neuronal connections in the injured or diseased brain, such as following stroke.

The gas7 protein potentiates NGF-mediated differentiation of PC12 cells.

Die gas7 Protein potenziert NGF-vermittelte Differenzierung von PC12-Zellen.

This study challenges the conventional view that metalloporphyrins protect cultured cortical neurons in models of cerebral ischemia by acting as intracellular catalytic antioxidants [superoxide dismutase (SOD) mimetics]. High SOD-active Mn(III)porphyrins meso-substituted with N,N'-dimethylimidazolium or N-alkylpyridinium groups did not protect neurons against oxygen-glucose deprivation (OGD), although lower SOD-active and -inactive para isomers protected against N-methyl-D-aspartate (NMDA) exposure. Mn(III)meso-tetrakis(4-benzoic acid)porphyrin (Mn(III)TBAP), as well as SOD-inactive metalloTBAPs and other phenyl ring- or beta-substituted metalloporphyrins that contained redox-insensitive metals, protected cultures against OGD and NMDA neurotoxicity. Crucially, neuroprotective metalloporphyrins suppressed OGD- or NMDA-induced rises in intracellular Ca2+ concentration in the same general rank order as observed for neuroprotection. Results from paraquat toxicity, intracellular fluorescence quenching, electrophysiology, mitochondrial Ca2+, and spontaneous synaptic activity experiments suggest a model in which metalloporphyrins, acting at the plasma membrane, protect neurons against OGD by suppressing postsynaptic NMDA receptor-mediated Ca2+ rises, thereby indirectly preventing accumulation of neurotoxic mitochondrial Ca2+ levels. Though neuroprotective in a manner not originally intended, SOD-inactive metalloporphyrins may represent promising therapeutic agents in diseases such as cerebral ischemia, in which Ca2+ toxicity is implicated. Conventional syntheses aimed at improving the catalytic antioxidant capability and/or intracellular access of metalloporphyrins may not yield improved efficacy in some disease models.

An alternative Ca2+-dependent mechanism of neuroprotection by the metalloporphyrin class of superoxide dismutase mimetics.

Eine alternative Ca2 +-abh&#xE4;ngige Mechanismen der Neuroprotektion durch die Metalloporphyrin Klasse von Superoxiddismutase Mimetika.

Obwohl organotypische hippocampal Segment Kulturen (OHSCs) verwendet werden, um Funktion innerhalb des Hippocampus zu untersuchen, wird die Wirkung der in-vitro-Wartung auf Proteinexpression nicht vollst&auml;ndig verstanden. Daher haben wir gepr&uuml;ft, entwicklungsbedingte &Auml;nderungen in Kulturen aus P8 Ratten vorbereitet und auf por&ouml;sen Membranen zwischen Mittel- und Atmosph&auml;re gepflegt. Zwischen 7 und 28 Tagen nach Explantation, ver&auml;nderte hippocampal Morphologie konnte nicht erkannt werden trotz einem deutlichen R&uuml;ckgang der Karte - 2 c und ein Mid-Range-Tau-Isoform von 21 DIV. Im selben Zeitraum niedriger GLIAL Ausdruck wurde beobachtet und GLIAL Kennzeichnung vorgeschlagen eine Migration der Astrozyten auf die Scheibe-Atmosph&auml;re-Schnittstelle. Im Gegensatz dazu der synaptischen Proteine Synaptophysin und PSD-95 stieg signifikant, aber GAP-43 war nicht. Die Erhaltung der Markhaltige Axone und Synapsen, zusammen mit den Gliazellen und endothelial Zellen, best&auml;tigte ultrastrukturelle Analyse. Dar&uuml;ber hinaus wurden intranukle&auml;ren Einschlussk&ouml;rperchen, die normalen Alterungsprozess in-vivo zugeordnet sind, in die CA1-Pyramidenschicht in Kulturen, die &auml;lter als 14 erkannt DIV. Als OHSCs wurden gepflegt, f&uuml;r ca. 3, 4 und 10 Wochen, einen Anstieg und dann fallen in der Auspr&auml;gung der Synaptophysin, vor allem, PSD-95 wurden gefunden und in &auml;hnlicher Weise der biphasische Trend wurden wesentliche &Auml;nderungen im Schaffer Sicherheiten hervorgerufen erregenden post-synaptic Potenziale von CA1 Neuronen. Unsere Daten nicht nur Ver&auml;nderungen im Zytoskelett, synaptische und nukleare Proteine im Management der Schnittstelle OHSCs zu beschreiben, sondern auch betonen das Potenzial des Modells f&uuml;r das Studium der altersbedingte Erscheinungen innerhalb des Hippocampus.

Zytoskelett, synaptische und nukleare Protein &Auml;nderungen zugeordnet Ratte Interface organotypische hippocampal Segment-Kultur-Entwicklung.

Although organotypic hippocampal slice cultures (OHSCs) are used to study function within the hippocampus, the effect of maintenance in vitro upon protein expression is not fully understood. Therefore, we examined developmental changes in cultures prepared from P8 rats and maintained on porous membranes between medium and atmosphere. Between 7 and 28 days following explantation, altered hippocampal morphology could not be detected despite a significant decrease in both MAP-2c and a mid-range tau isoform by 21 DIV. During the same period, lower GFAP expression was observed, and GFAP labeling suggested a migration of astrocytes to the slice-atmosphere interface. In contrast, levels of the synaptic proteins synaptophysin and PSD-95 were significantly increased, but GAP-43 was not. The preservation of myelinated axons and synapses, along with glial and endothelial cells, was confirmed by ultrastructural analysis. Furthermore, intranuclear inclusion bodies, which are associated with normal aging in vivo, were detected in the CA1 pyramidal layer in cultures older than 14 DIV. When OHSCs were maintained for approximately 3, 4, and 10 weeks, a rise and then fall in the expression of synaptophysin and, especially, PSD-95 were found, and the biphasic trend paralleled by significant changes in Schaffer collateral-evoked excitatory post-synaptic potentials from CA1 neurons. Our data not only describe changes in cytoskeletal, synaptic, and nuclear proteins related to the maintenance of interface OHSCs, but also emphasize the potential of the model for the study of age-related phenomena within the hippocampus.

Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development.

The importance of the hippocampus to learning and memory has attracted significant attention to how the structure responds to damage. Although many studies have used either the acute hippocampal slice preparation or organotypic hippocampal slice cultures, little work has been done to determine if the choice of model is an important variable. The present study examined whether differences exist in how each model responds to a commonly studied ischemic-like paradigm, oxygen-glucose deprivation. Following the insult, synaptic activity was examined by recording orthodromically evoked CA1 subfield responses, while mitochondrial activity was assessed by spectrophotometric measurement of formazan produced by metabolism of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride. The insult significantly decreased both synaptic and mitochondrial activity within acutely prepared slices, but a disparity existed between these measures in cultured slices. While evoked activity was greatly reduced by an insult of moderate duration, a much longer period was required to cause a comparable decrease in formazan production. Quantitative immunoblotting revealed that one possible explanation for the discrepancy was an elevated expression of astrocytes, which display resistance to hypoxia-aglycemia. Our data indicate that acutely prepared and cultured slices respond differently to ischemic-like challenge; therefore, assays examining viability in these models must consider their innate differences.

Synaptic activity and triphenyltetrazolium chloride metabolism are correlated after oxygen-glucose deprivation in acute, but not cultured, hippocampal slices.

Die Bedeutung des Hippocampus zu lernen und Ged&auml;chtnis hat erhebliche Aufmerksamkeit, wie die Struktur reagiert um zu besch&auml;digen. Obwohl viele Studien der akuten hippocampal Segment Vorbereitung oder organotypische hippocampal Segment Kulturen verwendet haben, hat wenig Arbeit geleistet, um festzustellen, ob die Wahl des Modells eine wichtige Variable ist. Die vorliegende Studie untersucht, ob Unterschiede in wie jedes Modell zu einem h&auml;ufig studierte isch&auml;mischen-&auml;hnlichen Paradigma, Sauerstoff-Glukose Entbehrung reagiert. Im Anschluss an die Beleidigung wurde synaptische Aktivit&auml;t untersucht, durch Orthodromically hervorgerufen CA1 Teilfeld Antworten, aufzeichnen, w&auml;hrend mitochondriale Aktivit&auml;t durch spektrophotometrische Messung der Formazankonzentration von Stoffwechsel 2,3,5-2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid Chlorid produziert bewertet wurde. Die Beleidigung deutlich verringert sowohl die synaptische als auch die mitochondriale Aktivit&auml;t innerhalb akut vorbereiteten Scheiben, aber eine Diskrepanz zwischen dieser Ma&szlig;nahmen in kultivierten Scheiben bestanden. W&auml;hrend evozierte Aktivit&auml;t durch eine Beleidigung des gem&auml;&szlig;igten Dauer stark reduziert wurde, war ein wesentlich l&auml;ngerer Zeitraum ben&ouml;tigt, um eine vergleichbare Abnahme der Formazankonzentration Produktion f&uuml;hren. Quantitative Immunoblotting ergab, dass eine m&ouml;gliche Erkl&auml;rung f&uuml;r die Diskrepanz erh&ouml;hten Ausdruck der Astrozyten, die Widerstand zur Hypoxie-Aglycemia anzeigen. Unsere Daten zeigen, dass akut vorbereitete und kultivierte Scheiben anders auf isch&auml;mische-artigen Herausforderung zu reagieren; Daher m&uuml;ssen die Proben untersuchen Lebensf&auml;higkeit in diesen Modellen ihre angeborene Unterschiede ber&uuml;cksichtigen.

Synaptische Aktivit&auml;t und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid Chlorid Stoffwechsel korrelieren nach Sauerstoff-Glukose Entbehrung in akuten, aber nicht kultiviert, hippocampal Scheiben.

Interface devices such as integrated planar patch-clamp chips are being developed to study the electrophysiological activity of neuronal networks grown in vitro. The utility of such devices will be dependent upon the ability to align neurons with interface features on the chip by controlling neuronal placement and by guiding cell connectivity. In this paper, we present a strategy to accomplish this goal. Patterned chemical modification of SiN surfaces with poly-d-lysine transferred from PDMS stamps was used to promote adhesion and guidance of cryo-preserved primary rat cortical neurons. We demonstrate that these neurons can be positioned and grown over microhole features which will ultimately serve as patch-clamp interfaces on the chip.

Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.

Interface-Ger&auml;te wie z. B. integrierte planare Patch-Clamp-Chips werden entwickelt, um die elektrophysiologische Aktivit&auml;t neuronaler Netzwerke gewachsen in-vitro-Studie. Das Dienstprogramm solcher Ger&auml;te werden abh&auml;ngig von der F&auml;higkeit, Neuronen mit Features f&uuml;r die Benutzeroberfl&auml;che auf dem Chip durch die Kontrolle der neuronalen Platzierung und durch leitende Verbindungen der Zelle ausrichten. In diesem Beitrag pr&auml;sentieren wir eine Strategie, um dieses Ziel zu erreichen. Gemusterte chemische Modifikation von S&uuml;nde Oberfl&auml;chen mit Poly-d-Lysin von PDMS Briefmarken &uuml;bertragen wurde verwendet, um die Adh&auml;sion und Leitung von Cryo erhaltenen prim&auml;ren Ratte kortikale Neuronen zu f&ouml;rdern. Wir zeigen, dass diese Neuronen positioniert und in Microhole-Features, die letztlich als Patch-Clamp-Schnittstellen auf dem Chip dient gewachsen werden k&ouml;nnen.

Zelle Platzierung und Leitlinien f&uuml;r die Substrate f&uuml;r Neurochip-Schnittstellen.

We report on a simple and high-yield manufacturing process for silicon planar patch-clamp chips, which allow low capacitance and series resistance from individually identified cultured neurons. Apertures are etched in a high-quality silicon nitride film on a silicon wafer; wells are opened on the backside of the wafer by wet etching and passivated by a thick deposited silicon dioxide film to reduce the capacitance of the chip and to facilitate the formation of a high-impedance cell to aperture seal. The chip surface is suitable for culture of neurons over a small orifice in the substrate with minimal leak current. Collectively, these features enable high-fidelity electrophysiological recording of transmembrane currents resulting from ion channel activity in cultured neurons. Using cultured Lymnaea neurons we demonstrate whole-cell current recordings obtained from a voltage-clamp stimulation protocol, and in current-clamp mode we report action potentials stimulated by membrane depolarization steps. Despite the relatively large size of these neurons, good temporal and spatial control of cell membrane voltage was evident. To our knowledge this is the first report of recording of ion channel activity and action potentials from neurons cultured directly on a planar patch-clamp chip. This interrogation platform has enormous potential as a novel tool to readily provide high-information content during pharmaceutical assays to investigate in vitro models of disease, as well as neuronal physiology and synaptic plasticity.

A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.

Wir berichten &uuml;ber eine einfache und hochverzinsliche Herstellungsprozess f&uuml;r Silizium planar Patch-Clamp-Chips, die niederohmigen Kapazit&auml;ts- und Serie von individuell bestimmte kultivierten Neuronen erm&ouml;glichen. &Ouml;ffnungen sind in einem qualitativ hochwertige Silizium-Nitrid-Film auf einem Silizium-Wafer ge&auml;tzt; Brunnen sind auf der R&uuml;ckseite des Wafers durch Nass&auml;tzen ge&ouml;ffnet und passiviert ein dickes hinterlegten Siliciumdioxid-Film, die Kapazit&auml;t des Chips zu reduzieren und die Bildung einer Zelle hochohmige auf Blende Siegel zu erleichtern. Die Chip-Oberfl&auml;che eignet sich f&uuml;r die Kultur der Neuronen &uuml;ber eine kleine &Ouml;ffnung in das Substrat mit aktuellen minimal Leck. Diese Features werden kollektiv, High-Fidelity-elektrophysiologische Aufnahme Transmembran Str&ouml;mungen aus Ion Channel-Aktivit&auml;ten in kultivierten Neuronen aktivieren. Mit kultivierte Lymnaea Neuronen zeigen wir ganze Zellen aktuelle Aufnahmen ein Klemm-Spannung Anregung Protokoll entnommen und im Klemm-Strom-Modus berichten wir Aktionspotentiale durch Membrane Depolarisierung Schritte angeregt. Trotz der relativ gro&szlig;en Gr&ouml;&szlig;e dieser Neuronen zeigte gute zeitliche und r&auml;umliche Kontrolle der Zellmembran Spannung. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht der Aufnahme von Ion Channel-Aktivit&auml;ten und Aktionspotentiale von Neuronen, die direkt auf eine planare Patch-Clamp-Chip kultiviert. Dieses Verh&ouml;r-Plattform hat enormes Potential als neuartige Werkzeug leicht hoher Informationsgehalt w&auml;hrend pharmazeutische Proben zur Untersuchung von in-vitro-Modelle von Krankheit, sowie neuronale Physiologie und synaptische Plastizit&auml;t bereitstellen.

Eine neuartige Patch-Clamp-Siliziumchip erlaubt originalgetreue Aufnahme von Ion Channel-Aktivit&auml;ten von funktional definierte Neuronen.

We present a polymer microchip capable of monitoring neuronal activity with a fidelity never before obtained on a planar patch-clamp device. Cardio-respiratory neurons Left Pedal Dorsal 1 (LPeD1) from mollusc Lymnaea were cultured on the microchip's polyimide surface for 2 to 4 hours. Cultured neurons formed high resistance seals (gigaseals) between the cell membrane and the surface surrounding apertures etched in the polyimide. Gigaseal formation was observed without applying external force, such as suction, on neurons. The formation of gigaseals, as well as the low access resistance and shunt capacitance values of the polymer microchip resulted in high-fidelity recordings. On-chip culture of neurons permitted, for the first time on a polymeric patch-clamp device, the recording of high fidelity physiological action potentials. Microfabrication of the hybrid poly(dimethylsiloxane)-polyimide (PDMS-PI) microchip is discussed, including a two-layer PDMS processing technique resulting in minimized shrinking variations.

High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.

Wir pr&auml;sentieren einen Polymer-Mikrochip &Uuml;berwachung neuronaler Aktivit&auml;t mit einer Treue f&auml;hig, noch nie auf eine planare Patch-Clamp-Ger&auml;t erh&auml;ltlich. Kardio-respiratorische Neuronen linke Pedal Dorsal 1 (LPeD1) von Weichtieren Lymnaea wurden auf dem Mikrochip-Polyimid-Oberfl&auml;che f&uuml;r 2 bis 4 Stunden kultiviert. Kultivierte Neuronen gebildet Hochwiderstandsf&auml;hige Dichtungen (Gigaseals) zwischen der Zellmembran und die Oberfl&auml;che rund um &Ouml;ffnungen in die Polyimid ge&auml;tzt. Gigaseal Bildung wurde beobachtet, ohne &auml;u&szlig;ere Kraft, wie z. B. Absaugung, auf Neuronen zu &uuml;bernehmen. Die Bildung von Gigaseals, sowie die niedrigen Zugang Widerstand und Shunt Kapazit&auml;tswerte von Polymer-Mikrochip f&uuml;hrten zu High-Fidelity-Aufnahmen. Auf dem Chip Kultur von Neuronen erlaubt, zum ersten Mal auf einem Polymeren Patch-Clamp-Ger&auml;t, die Aufzeichnung von High Fidelity physiologische Aktionspotentiale. Microfabrication des Hybrid Poly (Dimethylsiloxane)-Polyimid (PDMS-PI) Mikrochip wird diskutiert, einschlie&szlig;lich eine zweischichtige PDMS Verarbeitung-Technik, was zu schrumpfen Variationen minimiert.

High-Fidelity-Patch-Clamp-Aufnahmen von Neuronen, die auf einem Mikrochip Polymer kultiviert.

Patch-clamp is an important method to monitor the electrophysiological activity of cells and the role of pharmacological compounds on specific ion channel proteins. In recent years, planar patch-clamp chips have been developed as a higher throughput approach to the established glass-pipette method. However, proper conditions to optimize the high resistance cell-to-probe seals required to measure the small currents resulting from ion channel activity are still the subject of conjecture. Here, we report on the design of multiple-aperture (sieve) chips to rapidly facilitate assessment of cell-to-aperture interactions in statistically significant numbers. We propose a method to pre-screen the quality of seals based on a dye loading protocol through apertures in the chip and subsequent evaluation with fluorescence confocal microscopy. We also show the first scanning electron micrograph of a focused ion beam section of a cell in a patch-clamp chip aperture.

Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.

Patch-Clamp ist ein wichtiges Verfahren zur &Uuml;berwachung der elektrophysiologischen Aktivit&auml;t von Zellen und die Rolle der pharmakologischen Verbindungen auf bestimmte Ionen-Kanal-Proteine. In den letzten Jahren wurden planare Patch-Clamp-Chips als einen h&ouml;heren Durchsatz-Ansatz f&uuml;r die etablierten Glas-Pipette-Methode entwickelt. Ordnungsgem&auml;&szlig;en Zustand, die hohe Best&auml;ndigkeit-Zelle-zu-Probe-Dichtungen ben&ouml;tigt, um die kleine Str&ouml;me aus Ion Channel-Aktivit&auml;ten zu messen zu optimieren sind allerdings noch Gegenstand der Vermutung. Hier berichten wir &uuml;ber die Gestaltung des Multiple-Blende (Sieb) Chips schnell Bewertung der Zelle-zu-Blende Interaktionen in statistisch signifikanten Zahlen zu erleichtern. Wir schlagen eine Methode, um die Qualit&auml;t der Dichtungen, die auf der Grundlage eines Farbstoffes laden Protokoll durch &Ouml;ffnungen in den Chip und die anschlie&szlig;ende Auswertung mit konfokale Fluoreszenzmikroskopie Vorpr&uuml;fung. Wir zeigen auch die ersten Scan elektronenmikroskopische Aufnahme eines focused Ion Beam Abschnitts einer Zelle in einem Patch-Clamp-Chip-Blende.

Handy-Blende Interaktion in Patch-Clamp-Chips von Fluoreszenzmikroskopie und konzentriert-Ionen Balkenquerschnitte visualisiert.

Planar patch-clamp chip technology has been developed to enhance the assessment of novel compounds for therapeutic efficacy and safety. However, this technology has been limited to recording ion channels expressed in isolated suspended cells, making the study of ion channel function in synaptic transmission impractical. Recently, we developed single- and dual-recording site planar patch-clamp chips and demonstrated their capacity to record ion channel activity from neurons established in culture. Such capacity provides the opportunity to record from synaptically connected neurons cultured on-chip. In this study we reconstructed, on-chip, a simple synaptic circuit between cultured pre-synaptic visceral dorsal 4 neurons and post-synaptic left pedal dorsal 1 neurons isolated from the mollusk Lymnaea stagnalis. Here we report the first planar patch-clamp chip recordings of synaptic phenomena from these paired neurons and pharmacologically demonstrate the cholinergic nature of this synapse. We also report simultaneous dual-site recordings from paired neurons, and demonstrate dedicated cytoplasmic perfusion of individual neurons via on-chip subterranean microfluidics. This is the first application of planar patch-clamp technology to examine synaptic communication.

Recordings of cultured neurons and synaptic activity using patch-clamp chips.

Planare Patch-Clamp-Chip-Technologie wurde entwickelt, um die Beurteilung der neuartigen Compounds f&uuml;r die therapeutische Wirksamkeit und Sicherheit zu verbessern. Jedoch ist diese Technologie beschr&auml;nkt sich auf die Aufnahme von Ionenkan&auml;len in lokalisierten gesperrten Zellen ausgedr&uuml;ckt, machen das Studium der Ionen-Kanal-Funktion in der synaptischen &Uuml;bertragung unpraktisch gewesen. K&uuml;rzlich wir Single - und Dual-Recording-Website-planare Patch-Clamp-Chips entwickelt und demonstriert ihre Kapazit&auml;t aufzeichnen Ion Channel-Aktivit&auml;ten von Neuronen, die Kultur gegr&uuml;ndet. Dieser Kapazit&auml;t bietet die M&ouml;glichkeit, die Aufzeichnung von synaptisch verbundenen Neuronen kultiviert auf dem Chip. In dieser Studie, die wir rekonstruiert, isoliert auf dem Chip, eine einfache synaptische Schaltung zwischen kultivierten pre-synaptic viszerale dorsalen 4 Neuronen und post-synaptic linken Pedal dorsal 1 Neuronen aus dem Mollusk Spitzschlammschnecke. Hier berichten wir die ersten planare Patch-Clamp-Chip-Aufnahmen der synaptischen Ph&auml;nomene aus diesen Neuronen gekoppelt und pharmakologisch demonstrieren die cholinerge Natur dieser Synapse. Wir auch simultane Dual-Site-Aufnahmen von gepaarten Neuronen zu melden und engagierten zytoplasmatischen Perfusion einzelner Neuronen &uuml;ber unterirdische Mikrofluidik-Chip zu demonstrieren. Dies ist die erste Anwendung der planare Patch-Clamp-Technik, synaptische Kommunikation zu pr&uuml;fen.

Aufnahmen von kultivierten Neuronen und synaptische Aktivit&auml;t mit Patch-Clamp-Chips.

Choline is a micronutrient essential for the structural integrity of cellular membranes, and its presence at synapses follows either depolarization-induced pre-synaptic release or degradation of acetylcholine. Previous studies using whole-cell recording have shown that choline can modulate inhibitory input to hippocampal pyramidal neurons by acting upon nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) found on interneurons. However, little is known about how choline affects neuronal activity at the population level; therefore, we used extracellular recordings to assess its influence upon synaptic transmission in acutely prepared hippocampal slices. Choline caused a reversible depression of evoked field excitatory post-synaptic potentials (fEPSPs) in a concentration-dependent manner (10, 500, and 1000 ÂµM). When applied after the induction of long-term potentiation, choline-mediated depression (CMD) was still observed, and potentiation returned on wash-out. Complete blockade of CMD could not be achieved with antagonists for the Î±7 nAChR, to which choline is a full agonist, but was possible with a general nAChR antagonist. The ability of choline to increase paired-pulse facilitation, and the inability of applied gamma-aminobutyric acid (GABA) to mediate further depression of fEPSPs, suggests that the principal mechanism of choline's action was on the facilitation of neurotransmitter release. Our study provides evidence that choline can depress population-level activity, quite likely by facilitating the release of GABA from interneurons, and may thereby influence hippocampal function.

Choline-mediated depression of hippocampal synaptic transmission.

Cholin ist notwendig f&uuml;r die strukturelle Integrit&auml;t der Zellmembranen ein Mikron&auml;hrstoff, und seiner Pr&auml;senz auf Synapsen folgt entweder Depolarisation-induzierte pre-synaptic Freigabe und den Abbau von Acetylcholin. Fr&uuml;here Studien mit ganz-Zell-Aufnahme haben gezeigt, dass dieser Cholin hemmenden Input pyramidale Neuronen durch Handeln auf nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) finden Sie auf Interneuronen modulieren kann. Jedoch ist wenig bekannt &uuml;ber den Einfluss Cholin neuronalen Aktivit&auml;t auf Bev&ouml;lkerungsebene; Daher haben wir extrazellul&auml;re Aufnahmen verwendet, um seinen Einfluss bei der synaptischen &Uuml;bertragung in akut vorbereitete hippocampal Scheiben zu bewerten. Cholin verursacht eine reversible Depression evozierte Feld erregenden post-synaptic Potentiale (fEPSPs) in einer Konzentration-abh&auml;ngigen Weise (10, 500 und 1000 &micro;M). Wenn nach der Induktion der langfristige Erm&ouml;glichung angewendet, Cholin-vermittelte Depression (CMD) wurde noch beobachtet und Potenzierung Wash-out zur&uuml;ckgegeben. Komplette Blockade der CMD konnte nicht mit Antagonisten erreicht werden, f&uuml;r die &alpha;7 nAChR, die welche Cholin ein voller Agonist ist, sondern mit einem allgemeine nAChR-Antagonist m&ouml;glich war. Die F&auml;higkeit von Cholin, gepaart-Pulse Erleichterung zu erh&ouml;hen und die Unf&auml;higkeit der angewandten Gamma - Aminobutters&auml;ure (GABA), Depression der fEPSPs, weiter zu vermitteln zufolge war der wichtigste Mechanismus der Cholin Aktion zur Erleichterung der Neurotransmitter-Freisetzung. Unsere Studie belegt, dass Cholin kann deprimieren Bev&ouml;lkerungsebene Aktivit&auml;t, sehr wahrscheinlich durch die Freisetzung von GABA aus Interneuronen, Erleichterung und hippocampal Funktion kann dadurch beeinflussen.

Cholin-vermittelte Depression der hippocampal synaptischen &Uuml;bertragung.

All excitable cell functions rely upon ion channels that are embedded in their plasma membrane. Perturbations of ion channel structure or function result in pathologies ranging from cardiac dysfunction to neurodegenerative disorders. Consequently, to understand the functions of excitable cells and to remedy their pathophysiology, it is important to understand the ion channel functions under various experimental conditions - including exposure to novel drug targets. Glass pipette patch-clamp is the state of the art technique to monitor the intrinsic and synaptic properties of neurons. However, this technique is labor intensive and has low data throughput. Planar patch-clamp chips, integrated into automated systems, offer high throughputs but are limited to isolated cells from suspensions, thus limiting their use in modeling physiological function. These chips are therefore not most suitable for studies involving neuronal communication. Multielectrode arrays (MEAs), in contrast, have the ability to monitor network activity by measuring local field potentials from multiple extracellular sites, but specific ion channel activity is challenging to extract from these multiplexed signals. Here we describe a novel planar patch-clamp chip technology that enables the simultaneous high-resolution electrophysiological interrogation of individual neurons at multiple sites in synaptically connected neuronal networks, thereby combining the advantages of MEA and patch-clamp techniques. Each neuron can be probed through an aperture that connects to a dedicated subterranean microfluidic channel. Neurons growing in networks are aligned to the apertures by physisorbed or chemisorbed chemical cues. In this review, we describe the design and fabrication process of these chips, approaches to chemical patterning for cell placement, and present physiological data from cultured neuronal cells.

From understanding cellular function to novel drug discovery: the role of planar patch-clamp array chip technology.

Alle erregbar Zelle Funktionen st&uuml;tzen sich auf Ionenkan&auml;le, die in ihrer Plasmamembran eingebettet sind. St&ouml;rungen von Ionen-Kanal-Struktur oder Funktion f&uuml;hren Pathologien von kardialen Dysfunktion bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen. Um die Funktionen von excitable Zellen zu verstehen und ihre Pathophysiologie zu beseitigen, ist es daher wichtig zu verstehen, die Ion-Kanalfunktionen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen - einschlie&szlig;lich der Gef&auml;hrdung durch neuartige Droge-Ziele. Glas-Pipette Patch-Clamp ist die modernste Technik, die intrinsischen und synaptischen Eigenschaften der Neuronen zu &uuml;berwachen. Aber diese Technik ist arbeitsintensiv und hat geringen Datendurchsatz. Planare Patch-Clamp-Chips, Automationen, integriert bieten hohe Durchs&auml;tze aber begrenzt an isolierten Zellen von Suspensionen, ihre Verwendung bei der Modellierung physiologische Funktion eingeschr&auml;nkt sind. Diese Chips sind daher nicht f&uuml;r Studien mit neuronalen Kommunikation am geeignetsten. Multielectrode Arrays (MEAs), im Gegensatz dazu haben die Netzwerk-Aktivit&auml;t &uuml;berwachen durch Messung lokales Feld Potenziale mehrerer extrazellul&auml;re Standorte, aber spezifische Ion Channel-Aktivit&auml;ten ist eine Herausforderung, um aus dieser Multiplex-Signale zu extrahieren. Hier beschreiben wir eine neuartige planare Patch-Clamp-Chip-Technologie, die es erm&ouml;glicht die gleichzeitige hochaufl&ouml;sende elektrophysiologische Befragung des einzelnen Neuronen an mehreren Standorten in synaptisch neuronale Netzwerke, damit kombinieren die Vorteile von MEA und Patch-Clamp-Technik. Jedes Neuron kann durch eine Blende sondiert werden, die einen dedizierten unterirdischen Microfluidic-Kanal verbindet. Neuronen wachsen in Netzwerken werden die &Ouml;ffnungen von Physisorbed oder chemisorbed chemische Signale ausgerichtet. In diesem Bericht beschreiben wir den Prozess-Design und Fertigung dieser Chips, Ans&auml;tze zur chemischen Musterung f&uuml;r Zelle Platzierung und physiologische Daten von kultivierten neuronalen Zellen.

Article	Year
Protection of cortical neurons against oxygen-glucose deprivation and N-methyl-D-aspartate by DIDS and SITS. European journal of pharmacology\| PubMed ID: 12600690	2003
Preconditioning of cortical neurons by oxygen-glucose deprivation: tolerance induction through abbreviated neurotoxic signaling. American journal of physiology. Cell physiology\| PubMed ID: 12814913	2003
The gas7 protein potentiates NGF-mediated differentiation of PC12 cells. Brain research\| PubMed ID: 15725398	2005
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Synaptic activity and triphenyltetrazolium chloride metabolism are correlated after oxygen-glucose deprivation in acute, but not cultured, hippocampal slices. Brain research\| PubMed ID: 17904535	2007
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A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons. Biotechnology and bioengineering\| PubMed ID: 20648547	2010
High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip. Biomedical microdevices\| PubMed ID: 20694518	2010
Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections. Biotechnology and bioengineering\| PubMed ID: 21391207	2011
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From understanding cellular function to novel drug discovery: the role of planar patch-clamp array chip technology. Frontiers in pharmacology\| PubMed ID: 22007170	2011

Tanya Comas

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