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Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

We report on a simple and high-yield manufacturing process for silicon planar patch-clamp chips, which allow low capacitance and series resistance from individually identified cultured neurons. Apertures are etched in a high-quality silicon nitride film on a silicon wafer; wells are opened on the backside of the wafer by wet etching and passivated by a thick deposited silicon dioxide film to reduce the capacitance of the chip and to facilitate the formation of a high-impedance cell to aperture seal. The chip surface is suitable for culture of neurons over a small orifice in the substrate with minimal leak current. Collectively, these features enable high-fidelity electrophysiological recording of transmembrane currents resulting from ion channel activity in cultured neurons. Using cultured Lymnaea neurons we demonstrate whole-cell current recordings obtained from a voltage-clamp stimulation protocol, and in current-clamp mode we report action potentials stimulated by membrane depolarization steps. Despite the relatively large size of these neurons, good temporal and spatial control of cell membrane voltage was evident. To our knowledge this is the first report of recording of ion channel activity and action potentials from neurons cultured directly on a planar patch-clamp chip. This interrogation platform has enormous potential as a novel tool to readily provide high-information content during pharmaceutical assays to investigate in vitro models of disease, as well as neuronal physiology and synaptic plasticity.

A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.

Wir berichten &uuml;ber eine einfache und hochverzinsliche Herstellungsprozess f&uuml;r Silizium planar Patch-Clamp-Chips, die niederohmigen Kapazit&auml;ts- und Serie von individuell bestimmte kultivierten Neuronen erm&ouml;glichen. &Ouml;ffnungen sind in einem qualitativ hochwertige Silizium-Nitrid-Film auf einem Silizium-Wafer ge&auml;tzt; Brunnen sind auf der R&uuml;ckseite des Wafers durch Nass&auml;tzen ge&ouml;ffnet und passiviert ein dickes hinterlegten Siliciumdioxid-Film, die Kapazit&auml;t des Chips zu reduzieren und die Bildung einer Zelle hochohmige auf Blende Siegel zu erleichtern. Die Chip-Oberfl&auml;che eignet sich f&uuml;r die Kultur der Neuronen &uuml;ber eine kleine &Ouml;ffnung in das Substrat mit aktuellen minimal Leck. Diese Features werden kollektiv, High-Fidelity-elektrophysiologische Aufnahme Transmembran Str&ouml;mungen aus Ion Channel-Aktivit&auml;ten in kultivierten Neuronen aktivieren. Mit kultivierte Lymnaea Neuronen zeigen wir ganze Zellen aktuelle Aufnahmen ein Klemm-Spannung Anregung Protokoll entnommen und im Klemm-Strom-Modus berichten wir Aktionspotentiale durch Membrane Depolarisierung Schritte angeregt. Trotz der relativ gro&szlig;en Gr&ouml;&szlig;e dieser Neuronen zeigte gute zeitliche und r&auml;umliche Kontrolle der Zellmembran Spannung. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht der Aufnahme von Ion Channel-Aktivit&auml;ten und Aktionspotentiale von Neuronen, die direkt auf eine planare Patch-Clamp-Chip kultiviert. Dieses Verh&ouml;r-Plattform hat enormes Potential als neuartige Werkzeug leicht hoher Informationsgehalt w&auml;hrend pharmazeutische Proben zur Untersuchung von in-vitro-Modelle von Krankheit, sowie neuronale Physiologie und synaptische Plastizit&auml;t bereitstellen.

Eine neuartige Patch-Clamp-Siliziumchip erlaubt originalgetreue Aufnahme von Ion Channel-Aktivit&auml;ten von funktional definierte Neuronen.

Wir pr&auml;sentieren einen Polymer-Mikrochip &Uuml;berwachung neuronaler Aktivit&auml;t mit einer Treue f&auml;hig, noch nie auf eine planare Patch-Clamp-Ger&auml;t erh&auml;ltlich. Kardio-respiratorische Neuronen linke Pedal Dorsal 1 (LPeD1) von Weichtieren Lymnaea wurden auf dem Mikrochip-Polyimid-Oberfl&auml;che f&uuml;r 2 bis 4 Stunden kultiviert. Kultivierte Neuronen gebildet Hochwiderstandsf&auml;hige Dichtungen (Gigaseals) zwischen der Zellmembran und die Oberfl&auml;che rund um &Ouml;ffnungen in die Polyimid ge&auml;tzt. Gigaseal Bildung wurde beobachtet, ohne &auml;u&szlig;ere Kraft, wie z. B. Absaugung, auf Neuronen zu &uuml;bernehmen. Die Bildung von Gigaseals, sowie die niedrigen Zugang Widerstand und Shunt Kapazit&auml;tswerte von Polymer-Mikrochip f&uuml;hrten zu High-Fidelity-Aufnahmen. Auf dem Chip Kultur von Neuronen erlaubt, zum ersten Mal auf einem Polymeren Patch-Clamp-Ger&auml;t, die Aufzeichnung von High Fidelity physiologische Aktionspotentiale. Microfabrication des Hybrid Poly (Dimethylsiloxane)-Polyimid (PDMS-PI) Mikrochip wird diskutiert, einschlie&szlig;lich eine zweischichtige PDMS Verarbeitung-Technik, was zu schrumpfen Variationen minimiert.

High-Fidelity-Patch-Clamp-Aufnahmen von Neuronen, die auf einem Mikrochip Polymer kultiviert.

We present a polymer microchip capable of monitoring neuronal activity with a fidelity never before obtained on a planar patch-clamp device. Cardio-respiratory neurons Left Pedal Dorsal 1 (LPeD1) from mollusc Lymnaea were cultured on the microchip's polyimide surface for 2 to 4 hours. Cultured neurons formed high resistance seals (gigaseals) between the cell membrane and the surface surrounding apertures etched in the polyimide. Gigaseal formation was observed without applying external force, such as suction, on neurons. The formation of gigaseals, as well as the low access resistance and shunt capacitance values of the polymer microchip resulted in high-fidelity recordings. On-chip culture of neurons permitted, for the first time on a polymeric patch-clamp device, the recording of high fidelity physiological action potentials. Microfabrication of the hybrid poly(dimethylsiloxane)-polyimide (PDMS-PI) microchip is discussed, including a two-layer PDMS processing technique resulting in minimized shrinking variations.

High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.

All excitable cell functions rely upon ion channels that are embedded in their plasma membrane. Perturbations of ion channel structure or function result in pathologies ranging from cardiac dysfunction to neurodegenerative disorders. Consequently, to understand the functions of excitable cells and to remedy their pathophysiology, it is important to understand the ion channel functions under various experimental conditions - including exposure to novel drug targets. Glass pipette patch-clamp is the state of the art technique to monitor the intrinsic and synaptic properties of neurons. However, this technique is labor intensive and has low data throughput. Planar patch-clamp chips, integrated into automated systems, offer high throughputs but are limited to isolated cells from suspensions, thus limiting their use in modeling physiological function. These chips are therefore not most suitable for studies involving neuronal communication. Multielectrode arrays (MEAs), in contrast, have the ability to monitor network activity by measuring local field potentials from multiple extracellular sites, but specific ion channel activity is challenging to extract from these multiplexed signals. Here we describe a novel planar patch-clamp chip technology that enables the simultaneous high-resolution electrophysiological interrogation of individual neurons at multiple sites in synaptically connected neuronal networks, thereby combining the advantages of MEA and patch-clamp techniques. Each neuron can be probed through an aperture that connects to a dedicated subterranean microfluidic channel. Neurons growing in networks are aligned to the apertures by physisorbed or chemisorbed chemical cues. In this review, we describe the design and fabrication process of these chips, approaches to chemical patterning for cell placement, and present physiological data from cultured neuronal cells.

From understanding cellular function to novel drug discovery: the role of planar patch-clamp array chip technology.

Alle erregbar Zelle Funktionen st&uuml;tzen sich auf Ionenkan&auml;le, die in ihrer Plasmamembran eingebettet sind. St&ouml;rungen von Ionen-Kanal-Struktur oder Funktion f&uuml;hren Pathologien von kardialen Dysfunktion bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen. Um die Funktionen von excitable Zellen zu verstehen und ihre Pathophysiologie zu beseitigen, ist es daher wichtig zu verstehen, die Ion-Kanalfunktionen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen - einschlie&szlig;lich der Gef&auml;hrdung durch neuartige Droge-Ziele. Glas-Pipette Patch-Clamp ist die modernste Technik, die intrinsischen und synaptischen Eigenschaften der Neuronen zu &uuml;berwachen. Aber diese Technik ist arbeitsintensiv und hat geringen Datendurchsatz. Planare Patch-Clamp-Chips, Automationen, integriert bieten hohe Durchs&auml;tze aber begrenzt an isolierten Zellen von Suspensionen, ihre Verwendung bei der Modellierung physiologische Funktion eingeschr&auml;nkt sind. Diese Chips sind daher nicht f&uuml;r Studien mit neuronalen Kommunikation am geeignetsten. Multielectrode Arrays (MEAs), im Gegensatz dazu haben die Netzwerk-Aktivit&auml;t &uuml;berwachen durch Messung lokales Feld Potenziale mehrerer extrazellul&auml;re Standorte, aber spezifische Ion Channel-Aktivit&auml;ten ist eine Herausforderung, um aus dieser Multiplex-Signale zu extrahieren. Hier beschreiben wir eine neuartige planare Patch-Clamp-Chip-Technologie, die es erm&ouml;glicht die gleichzeitige hochaufl&ouml;sende elektrophysiologische Befragung des einzelnen Neuronen an mehreren Standorten in synaptisch neuronale Netzwerke, damit kombinieren die Vorteile von MEA und Patch-Clamp-Technik. Jedes Neuron kann durch eine Blende sondiert werden, die einen dedizierten unterirdischen Microfluidic-Kanal verbindet. Neuronen wachsen in Netzwerken werden die &Ouml;ffnungen von Physisorbed oder chemisorbed chemische Signale ausgerichtet. In diesem Bericht beschreiben wir den Prozess-Design und Fertigung dieser Chips, Ans&auml;tze zur chemischen Musterung f&uuml;r Zelle Platzierung und physiologische Daten von kultivierten neuronalen Zellen.

Article	Year
A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons. Biotechnology and bioengineering\| PubMed ID: 20648547	2010
High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip. Biomedical microdevices\| PubMed ID: 20694518	2010
From understanding cellular function to novel drug discovery: the role of planar patch-clamp array chip technology. Frontiers in pharmacology\| PubMed ID: 22007170	2011

Mike W. Denhoff

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