culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Defining the attributes of individual central pattern-generating (CPG) neurons underlying various rhythmic behaviors are fundamental to our understanding of how the brain controls motor programs, such as respiration and locomotion. To this end, we have explored a simple invertebrate preparation in which the neuronal basis of respiratory rhythmogenesis can be investigated from the whole animal to a single cell level. An identified dopaminergic neuron, termed right pedal dorsal 1 (RPeD1), is a component of the CPG network which controls hypoxia-driven, aerial respiration in the fresh water snail Lymnaea stagnalis. Using intact, semi-intact and isolated brain preparations, we have discovered that in addition to its role as a respiratory CPG neuron, RPeD1 co-ordinates sensory-motor input from the pneumostome (the respiratory orifice) at the water/air interface to initiate respiratory rhythm generation. An additional, novel role of RPeD1 was also found. Specifically, direct intracellular stimulation of RPeD1 induced pneumostome openings, in the absence of motor neuronal activity. To determine further the role of RPeD1 in the respiratory behavior of intact animals, either its axon was severed or the soma selectively killed. Many components of the respiratory behavior in the intact animals were found to be perturbed following RPeD1 axotomy or 'somatomy' (soma removed). Taken together, the data presented provide a direct demonstration that RPeD1 is a multifunctional CPG neuron, which also serves many additional roles in the control of breathing behavior, ranging from co-ordination of mechanosensory input to the motor control of the respiratory orifice.

An identified central pattern-generating neuron co-ordinates sensory-motor components of respiratory behavior in Lymnaea.

Definieren Sie die Attribute der einzelnen zentralen Muster schaffenden (CPG) sind Neuronen zugrunde liegen verschiedene rhythmische Verhaltensweisen grundlegend f&uuml;r unser Verst&auml;ndnis von, wie das Gehirn motorische Programme wie Atmung und Fortbewegung steuert. Zu diesem Zweck haben wir eine einfache Wirbellose Vorbereitung, in der die Neuronale Grundlagen der Atemwege-Rhythmogenesis untersucht werden kann, aus dem ganzen Tier untersucht, auf eine einzelne Zelle-Ebene. Eine identifizierte dopaminergen Neuron, genannt rechts Pedal dorsal 1 (RPeD1), ist eine Komponente des CPG-Netzwerks die Hypoxie-getrieben, Antenne Atmung in der S&uuml;&szlig;wasser-Schnecken-Spitzschlammschnecke steuert. Verwenden intakt, semi-intact und isolierten Gehirn Vorbereitungen, haben wir entdeckt, dass neben ihrer Rolle als ein Atemwege CPG-Neuron, RPeD1 Koordinaten sensorisch-motorischen aus der Pneumostome (zur &Ouml;ffnung der Atemwege) Eingang an der Wasser/Luft-Schnittstelle zu initiieren Atemwege Rhythmus-Generation. Eine weitere, neuartige Rolle des RPeD1 wurde auch gefunden. Insbesondere induzierte direkte intrazellul&auml;re Stimulation des RPeD1 Pneumostome &Ouml;ffnungen, ohne motor neuronale Aktivit&auml;t. Um weiter die Rolle des RPeD1 in die Atemwege Verhalten von intakten Tieren, entweder bestimmen seine Axon durchtrennt oder die Soma gezielt get&ouml;tet. Viele Komponenten des respiratorischen Verhaltens in den intakten Tieren wurden gefunden, nach RPeD1 Axotomie oder &#39;Somatomy&#39; (Soma entfernt) gest&ouml;rt sein. Zusammengenommen bieten die pr&auml;sentierten Daten ein direkter Beweis, dass RPeD1 eine multifunktionale CPG-Neuron, das auch viele weitere Rollen in der Kontrolle ist der Atmung Verhalten, reicht von der Koordination der Mechanosensory-Eingabe f&uuml;r die Motorsteuerung der Atemwege Blende dient.

Eine identifizierte zentrale Muster generieren Neuron koordiniert sensorisch-motorischen Komponenten der Atemwege Verhalten in Lymnaea.

Breathing is an essential homeostatic behavior regulated by central neuronal networks, often called central pattern generators (CPGs). Despite ongoing advances in our understanding of the neural control of breathing, the basic mechanisms by which peripheral input modulates the activities of the central respiratory CPG remain elusive. This lack of fundamental knowledge vis-Ã -vis the role of peripheral influences in the control of the respiratory CPG is due in large part to the complexity of mammalian respiratory control centres. We have therefore developed a simpler invertebrate model to study the basic cellular and synaptic mechanisms by which a peripheral chemosensory input affects the central respiratory CPG. Here we report on the identification and characterization of peripheral chemoreceptor cells (PCRCs) that relay hypoxia-sensitive chemosensory information to the known respiratory CPG neuron right pedal dorsal 1 in the mollusk Lymnaea stagnalis. Selective perfusion of these PCRCs with hypoxic saline triggered bursting activity in these neurons and when isolated in cell culture these cells also demonstrated hypoxic sensitivity that resulted in membrane depolarization and spiking activity. When cocultured with right pedal dorsal 1, the PCRCs developed synapses that exhibited a form of short-term synaptic plasticity in response to hypoxia. Finally, osphradial denervation in intact animals significantly perturbed respiratory activity compared with their sham counterparts. This study provides evidence for direct synaptic connectivity between a peripheral regulatory element and a central respiratory CPG neuron, revealing a potential locus for hypoxia-induced synaptic plasticity underlying breathing behavior.

Peripheral oxygen-sensing cells directly modulate the output of an identified respiratory central pattern generating neuron.

Atmen ist ein wesentlicher hom&ouml;ostatischen Verhalten durch zentrale neuronale Netze, die oft als zentrale Muster Generatoren (Verbrauchsg&uuml;ter) geregelt. Trotz laufenden Fortschritte in unserem Verst&auml;ndnis der neuronalen Kontrolle der Atmung bleiben die grundlegenden Mechanismen, die durch die periphere Eingabe die Aktivit&auml;ten von der zentralen Atemwege CPG moduliert tr&uuml;gerisch. Diese mangelnde Grundkenntnisse-gegen&uuml;ber der Rolle der peripheren Einfl&uuml;sse die Kontrolle &uuml;ber die Atemwege CPG ist zum gro&szlig;en Teil auf die Komplexit&auml;t der S&auml;ugetier-Atemwege Kontrollzentren. Wir haben deshalb ein einfacheres Wirbellosen Modell um die grundlegenden zellul&auml;ren und synaptischen Mechanismen zu studieren, mit denen eine periphere chemosensory Eingabe die zentrale Atemwege CPG wirkt sich, entwickelt. Hier berichten wir &uuml;ber die Identifizierung und Charakterisierung von peripheren Chemorezeptor-Zellen (PCRCs), die Hypoxie-Sensitive chemosensory an das bekannte Atemwege CPG Neuron richtige Pedal dorsal 1 in dem Mollusk Spitzschlammschnecke Informationen. Selektiver Perfusion von diesen PCRCs mit Hypoxie Kochsalzl&ouml;sung ausgel&ouml;st platzende Aktivit&auml;t in dieser Neuronen und wenn in Zellkulturen isoliert diese Zellen auch demonstriert Hypoxie Empfindlichkeit, die Membran-Depolarisierung und spiking Aktivit&auml;t f&uuml;hrte. Als cocultured mit ganzer Pedal dorsal 1, entwickelte die PCRCs Synapsen, die eine Form der kurzfristigen synaptische Plastizit&auml;t als Reaktion auf Hypoxie ausgestellt. Schlie&szlig;lich umwerfen Osphradial Denervation bei intakten Tieren deutlich Atmungs Aktivit&auml;t verglichen mit ihren Gegenst&uuml;cken Schein. Diese Studie liefert Beweise f&uuml;r direkten synaptische Verbindungen zwischen einem peripheren regulatorischen Element und eine zentrale Atemwege CPG-Neuron, offenbart ein m&ouml;glicher Ort f&uuml;r Hypoxie-induzierten synaptische Plastizit&auml;t Atmung Verhalten zugrunde.

Periphere Zellen mit Sauerstoff-Sensorik modulieren direkt die Ausgabe einer identifizierten zentrale Atemmuster generieren Neuron.

Current treatment regimes for a variety of mental disorders involve various selective serotonin reuptake inhibitors such as Fluoxetine (Prozac). Although these drugs may 'manage' the patient better, there has not been a significant change in the treatment paradigm over the years and neither have the outcomes improved. There is also considerable debate as to the effectiveness of various selective serotonin reuptake inhibitors and their potential side-effects on neuronal architecture and function. In this study, using mammalian cortical neurons, a dorsal root ganglia cell line (F11 cells) and identified Lymnaea stagnalis neurons, we provide the first direct and unequivocal evidence that clinically relevant concentrations of Fluoxetine induce growth cone collapse and neurite retraction of both serotonergic and non-serotonergic neurons alike in a dose-dependent manner. Using intracellular recordings and calcium imaging techniques, we further demonstrate that the mechanism underlying Fluoxetine-induced effects on neurite retraction from Lymnaea neurons may involve lowering of intracellular calcium and a subsequent retardation of growth cone cytoskeleton. Using soma-soma synapses between identified presynaptic and postsynaptic Lymnaea neurons, we provide further direct evidence that clinically used concentrations of Fluoxetine also block synaptic transmission and synapse formation between cholinergic neurons. Our study raises alarms over potentially devastating side-effects of this antidepressant drug on neurite outgrowth and synapse formation in a developing/regenerating brain. Our data also demonstrate that drugs such as Fluoxetine may not just affect communication between serotonergic neurons but that the detrimental effects are widespread and involve neurons of various phenotypes from both vertebrate and invertebrate species.

Antidepressant fluoxetine suppresses neuronal growth from both vertebrate and invertebrate neurons and perturbs synapse formation between Lymnaea neurons.

Aktuelle Behandlung Regime f&uuml;r eine Vielzahl von psychischen St&ouml;rungen beinhalten verschiedene selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer wie Fluoxetin (Prozac). Obwohl diese Medikamente die Patienten besser verwalten k&ouml;nnen, eine bedeutende &Auml;nderung im Paradigma Behandlung im Laufe der Jahre hat es nicht gegeben und haben weder die Ergebnisse verbessert. Es gibt auch betr&auml;chtliche Debatte &uuml;ber die Wirksamkeit der verschiedenen selektive Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmer und ihre m&ouml;glichen Nebenwirkungen auf neuronalen Architektur und Funktion. In dieser Studie bieten mit S&auml;ugetier-kortikale Neuronen, eine Spinalganglien Ganglien-Zelllinie (F11-Zellen) und identifizierten Lymnaea Stagnalis Neuronen, wir die erste direkte und eindeutige Beweise, dass klinisch relevante Konzentrationen von Fluoxetin Wachstum Kegel Zusammenbruch und Neurit Retraktion der serotonergen sowohl die nicht-serotonergen Neuronen gleicherma&szlig;en eine dosisabh&auml;ngige Weise bewegen. Mit intrazellul&auml;ren Aufnahmen und Kalzium, die bildgebenden Verfahren, demonstrieren wir weiter, dass die Mechanismus zugrunde liegenden induziert durch Fluoxetin Auswirkungen auf Neurit Retraktion von Lymnaea Neuronen Senkung des intrazellul&auml;ren Calcium und eine nachfolgende Retardierung des Wachstums Kegel Zytoskeletts umfassen k&ouml;nnen. Zwischen den identifizierten pr&auml;synaptischen und postsynaptisches Lymnaea Neuronen Synapsen mit Soma Soma, bieten wir Ihnen weitere direkte Beweise, die klinisch Konzentrationen von Fluoxetin auch Block synaptischen &Uuml;bertragung und Synapse Bildung zwischen cholinergen Neuronen. Unsere Studie wirft Alarme &uuml;ber m&ouml;glicherweise verheerenden Nebenwirkungen dieses Medikaments Antidepressivum auf Neurit Auswuchs und Synapse-Bildung im Gehirn entwickeln/regenerieren. Unsere Daten zeigen auch, dass Drogen, wie z. B. Fluoxetin nicht nur Kommunikation zwischen serotonergen Neuronen beeinflussen kann, sondern dass die sch&auml;dlichen Auswirkungen weit verbreitet sind und Neuronen der verschiedenen Ph&auml;notypen von sowohl vertebrate und wirbellosen Tierarten betreffen.

Antidepressivum Fluoxetin unterdr&uuml;ckt neuronale Wachstum von sowohl vertebrate und Wirbellosen Neuronen und w&uuml;hlt Synapse Bildung zwischen Lymnaea Neuronen.

We report on a simple and high-yield manufacturing process for silicon planar patch-clamp chips, which allow low capacitance and series resistance from individually identified cultured neurons. Apertures are etched in a high-quality silicon nitride film on a silicon wafer; wells are opened on the backside of the wafer by wet etching and passivated by a thick deposited silicon dioxide film to reduce the capacitance of the chip and to facilitate the formation of a high-impedance cell to aperture seal. The chip surface is suitable for culture of neurons over a small orifice in the substrate with minimal leak current. Collectively, these features enable high-fidelity electrophysiological recording of transmembrane currents resulting from ion channel activity in cultured neurons. Using cultured Lymnaea neurons we demonstrate whole-cell current recordings obtained from a voltage-clamp stimulation protocol, and in current-clamp mode we report action potentials stimulated by membrane depolarization steps. Despite the relatively large size of these neurons, good temporal and spatial control of cell membrane voltage was evident. To our knowledge this is the first report of recording of ion channel activity and action potentials from neurons cultured directly on a planar patch-clamp chip. This interrogation platform has enormous potential as a novel tool to readily provide high-information content during pharmaceutical assays to investigate in vitro models of disease, as well as neuronal physiology and synaptic plasticity.

A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.

Wir berichten &uuml;ber eine einfache und hochverzinsliche Herstellungsprozess f&uuml;r Silizium planar Patch-Clamp-Chips, die niederohmigen Kapazit&auml;ts- und Serie von individuell bestimmte kultivierten Neuronen erm&ouml;glichen. &Ouml;ffnungen sind in einem qualitativ hochwertige Silizium-Nitrid-Film auf einem Silizium-Wafer ge&auml;tzt; Brunnen sind auf der R&uuml;ckseite des Wafers durch Nass&auml;tzen ge&ouml;ffnet und passiviert ein dickes hinterlegten Siliciumdioxid-Film, die Kapazit&auml;t des Chips zu reduzieren und die Bildung einer Zelle hochohmige auf Blende Siegel zu erleichtern. Die Chip-Oberfl&auml;che eignet sich f&uuml;r die Kultur der Neuronen &uuml;ber eine kleine &Ouml;ffnung in das Substrat mit aktuellen minimal Leck. Diese Features werden kollektiv, High-Fidelity-elektrophysiologische Aufnahme Transmembran Str&ouml;mungen aus Ion Channel-Aktivit&auml;ten in kultivierten Neuronen aktivieren. Mit kultivierte Lymnaea Neuronen zeigen wir ganze Zellen aktuelle Aufnahmen ein Klemm-Spannung Anregung Protokoll entnommen und im Klemm-Strom-Modus berichten wir Aktionspotentiale durch Membrane Depolarisierung Schritte angeregt. Trotz der relativ gro&szlig;en Gr&ouml;&szlig;e dieser Neuronen zeigte gute zeitliche und r&auml;umliche Kontrolle der Zellmembran Spannung. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht der Aufnahme von Ion Channel-Aktivit&auml;ten und Aktionspotentiale von Neuronen, die direkt auf eine planare Patch-Clamp-Chip kultiviert. Dieses Verh&ouml;r-Plattform hat enormes Potential als neuartige Werkzeug leicht hoher Informationsgehalt w&auml;hrend pharmazeutische Proben zur Untersuchung von in-vitro-Modelle von Krankheit, sowie neuronale Physiologie und synaptische Plastizit&auml;t bereitstellen.

Eine neuartige Patch-Clamp-Siliziumchip erlaubt originalgetreue Aufnahme von Ion Channel-Aktivit&auml;ten von funktional definierte Neuronen.

We present a polymer microchip capable of monitoring neuronal activity with a fidelity never before obtained on a planar patch-clamp device. Cardio-respiratory neurons Left Pedal Dorsal 1 (LPeD1) from mollusc Lymnaea were cultured on the microchip's polyimide surface for 2 to 4 hours. Cultured neurons formed high resistance seals (gigaseals) between the cell membrane and the surface surrounding apertures etched in the polyimide. Gigaseal formation was observed without applying external force, such as suction, on neurons. The formation of gigaseals, as well as the low access resistance and shunt capacitance values of the polymer microchip resulted in high-fidelity recordings. On-chip culture of neurons permitted, for the first time on a polymeric patch-clamp device, the recording of high fidelity physiological action potentials. Microfabrication of the hybrid poly(dimethylsiloxane)-polyimide (PDMS-PI) microchip is discussed, including a two-layer PDMS processing technique resulting in minimized shrinking variations.

High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.

Wir pr&auml;sentieren einen Polymer-Mikrochip &Uuml;berwachung neuronaler Aktivit&auml;t mit einer Treue f&auml;hig, noch nie auf eine planare Patch-Clamp-Ger&auml;t erh&auml;ltlich. Kardio-respiratorische Neuronen linke Pedal Dorsal 1 (LPeD1) von Weichtieren Lymnaea wurden auf dem Mikrochip-Polyimid-Oberfl&auml;che f&uuml;r 2 bis 4 Stunden kultiviert. Kultivierte Neuronen gebildet Hochwiderstandsf&auml;hige Dichtungen (Gigaseals) zwischen der Zellmembran und die Oberfl&auml;che rund um &Ouml;ffnungen in die Polyimid ge&auml;tzt. Gigaseal Bildung wurde beobachtet, ohne &auml;u&szlig;ere Kraft, wie z. B. Absaugung, auf Neuronen zu &uuml;bernehmen. Die Bildung von Gigaseals, sowie die niedrigen Zugang Widerstand und Shunt Kapazit&auml;tswerte von Polymer-Mikrochip f&uuml;hrten zu High-Fidelity-Aufnahmen. Auf dem Chip Kultur von Neuronen erlaubt, zum ersten Mal auf einem Polymeren Patch-Clamp-Ger&auml;t, die Aufzeichnung von High Fidelity physiologische Aktionspotentiale. Microfabrication des Hybrid Poly (Dimethylsiloxane)-Polyimid (PDMS-PI) Mikrochip wird diskutiert, einschlie&szlig;lich eine zweischichtige PDMS Verarbeitung-Technik, was zu schrumpfen Variationen minimiert.

High-Fidelity-Patch-Clamp-Aufnahmen von Neuronen, die auf einem Mikrochip Polymer kultiviert.

All brain functions, ranging from motor behaviour to cognition, depend on precise developmental patterns of synapse formation between the growth cones of both pre- and postsynaptic neurons. While the molecular evidence for the presence of 'pre-assembled' elements of synaptic machinery prior to physical contact is beginning to emerge, the precise timing of functional synaptogenesis between the growth cones has not yet been defined. Moreover, it is unclear whether an initial assembly of various synaptic molecules located at the extrasomal regions (e.g. growth cones) can indeed result in fully mature and consolidated synapses in the absence of somata signalling. Such evidence is difficult to obtain both in vivo and in vitro because the extrasomal sites are often challenging, if not impossible, to access for electrophysiological analysis. Here we demonstrate a novel approach to precisely define various steps underlying synapse formation between the isolated growth cones of individually identifiable pre- and postsynaptic neurons from the mollusc Lymnaea stagnalis. We show for the first time that isolated growth cones transformed into 'growth balls' have an innate propensity to develop specific and multiple synapses within minutes of physical contact. We also demonstrate that a prior 'synaptic history' primes the presynaptic growth ball to form synapses quicker with subsequent partners. This is the first demonstration that isolated Lymnaea growth cones have the necessary machinery to form functional synapses.

A novel approach reveals temporal patterns of synaptogenesis between the isolated growth cones of Lymnaea neurons.

Alle Gehirnfunktionen, Kognition, vom motor Verhalten bis h&auml;ngen pr&auml;zise Entwicklungs-Muster Synapse-Formation zwischen die Kegel Wachstum sowohl vor-als auch postsynaptisches Neuronen. W&auml;hrend die molekulare Beweise f&uuml;r das Vorhandensein von &#39;vormontierte&#39; Elemente der synaptischen Maschinen vor K&ouml;rperkontakt zu entstehen beginnt, hat der genaue Zeitpunkt der funktionalen Synaptogenese zwischen die Kegel Wachstum noch nicht definiert wurde. Dar&uuml;ber hinaus ist unklar, ob tats&auml;chlich eine Erstmontage verschiedene synaptische Molek&uuml;le am Extrasomal Regionen (z. B. Wachstum Zapfen) voll ausgereift und konsolidierte Synapsen in Ermangelung Somata Signalisierung f&uuml;hren kann. Dieser Nachweis ist schwierig, erhalten sowohl in-vivo und in vitro, da die Extrasomal-Sites oft schwierig sind, wenn nicht unm&ouml;glich, Zugriff auf f&uuml;r elektrophysiologische Analyse. Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz, um genau zu definieren, verschiedene Schritte Synapse Bildung zwischen der isolierten Wachstum Konen individuell identifizierbaren vor- und postsynaptisches Neuronen aus der Molluske Spitzschlammschnecke zugrunde. Wir zeigen erstmals, dass isolierte Wachstum Zapfen verwandelt &#39;Wachstum Balls&#39; eine angeborene Neigung zu bestimmten entwickeln und mehrere Synapsen innerhalb von Minuten K&ouml;rperkontakt. Wir zeigen auch, dass eine vorherige &quot;synaptische Geschichte&quot; den pr&auml;synaptischen Wachstum Ball Form Synapsen schneller mit weiteren Partnern Primzahlen. Dies ist die erste Demonstration, die isoliert Lymnaea Wachstum Zapfen haben die notwendige Maschinen funktionale Synapsen zu bilden.

Ein neuartiger Ansatz offenbart zeitlichen Muster der Synaptogenese zwischen der isolierten Wachstum Konen Lymnaea Neuronen.

Planar patch-clamp chip technology has been developed to enhance the assessment of novel compounds for therapeutic efficacy and safety. However, this technology has been limited to recording ion channels expressed in isolated suspended cells, making the study of ion channel function in synaptic transmission impractical. Recently, we developed single- and dual-recording site planar patch-clamp chips and demonstrated their capacity to record ion channel activity from neurons established in culture. Such capacity provides the opportunity to record from synaptically connected neurons cultured on-chip. In this study we reconstructed, on-chip, a simple synaptic circuit between cultured pre-synaptic visceral dorsal 4 neurons and post-synaptic left pedal dorsal 1 neurons isolated from the mollusk Lymnaea stagnalis. Here we report the first planar patch-clamp chip recordings of synaptic phenomena from these paired neurons and pharmacologically demonstrate the cholinergic nature of this synapse. We also report simultaneous dual-site recordings from paired neurons, and demonstrate dedicated cytoplasmic perfusion of individual neurons via on-chip subterranean microfluidics. This is the first application of planar patch-clamp technology to examine synaptic communication.

Recordings of cultured neurons and synaptic activity using patch-clamp chips.

Planare Patch-Clamp-Chip-Technologie wurde entwickelt, um die Beurteilung der neuartigen Compounds f&uuml;r die therapeutische Wirksamkeit und Sicherheit zu verbessern. Jedoch ist diese Technologie beschr&auml;nkt sich auf die Aufnahme von Ionenkan&auml;len in lokalisierten gesperrten Zellen ausgedr&uuml;ckt, machen das Studium der Ionen-Kanal-Funktion in der synaptischen &Uuml;bertragung unpraktisch gewesen. K&uuml;rzlich wir Single - und Dual-Recording-Website-planare Patch-Clamp-Chips entwickelt und demonstriert ihre Kapazit&auml;t aufzeichnen Ion Channel-Aktivit&auml;ten von Neuronen, die Kultur gegr&uuml;ndet. Dieser Kapazit&auml;t bietet die M&ouml;glichkeit, die Aufzeichnung von synaptisch verbundenen Neuronen kultiviert auf dem Chip. In dieser Studie, die wir rekonstruiert, isoliert auf dem Chip, eine einfache synaptische Schaltung zwischen kultivierten pre-synaptic viszerale dorsalen 4 Neuronen und post-synaptic linken Pedal dorsal 1 Neuronen aus dem Mollusk Spitzschlammschnecke. Hier berichten wir die ersten planare Patch-Clamp-Chip-Aufnahmen der synaptischen Ph&auml;nomene aus diesen Neuronen gekoppelt und pharmakologisch demonstrieren die cholinerge Natur dieser Synapse. Wir auch simultane Dual-Site-Aufnahmen von gepaarten Neuronen zu melden und engagierten zytoplasmatischen Perfusion einzelner Neuronen &uuml;ber unterirdische Mikrofluidik-Chip zu demonstrieren. Dies ist die erste Anwendung der planare Patch-Clamp-Technik, synaptische Kommunikation zu pr&uuml;fen.

Aufnahmen von kultivierten Neuronen und synaptische Aktivit&auml;t mit Patch-Clamp-Chips.

Short-term plasticity is thought to form the basis for working memory, the cellular mechanisms of which are the least understood in the nervous system. In this study, using in vitro reconstructed synapses between the identified Lymnaea neuron visceral dorsalâ€ƒ4 (VD4) and left pedal dorsalâ€ƒ1 (LPeD1), we demonstrate a novel form of short-term potentiation (STP) which is 'use'- but not time-dependent, unlike most previously defined forms of short-term synaptic plasticity. Using a triple-cell configuration we demonstrate for the first time that a single presynaptic neuron can reliably potentiate both inhibitory and excitatory synapses. We further demonstrate that, unlike previously described forms of STP, the synaptic potentiation between Lymnaea neurons does not involve postsynaptic receptor sensitization or presynaptic residual calcium. Finally, we provide evidence that STP at the VD4-LPeD1 synapse requires presynaptic calcium/calmodulin dependent kinaseâ€ƒII (CaMKII). Taken together, our study identifies a novel form of STP which may provide the basis for both short- and long-term potentiation, in the absence of any protein synthesis-dependent steps, and involve CaMKII activity exclusively in the presynaptic cell.

A novel form of presynaptic CaMKII-dependent short-term potentiation between Lymnaea neurons.

Kurzfristige Plastizit&auml;t ist vermutlich die Grundlage f&uuml;r Arbeitsspeicher, bilden die zellul&auml;ren Mechanismen, von denen die wenigsten verstanden im Nervensystem sind. In dieser Studie mit in-vitro-Synapsen zwischen den identifizierten Lymnaea Neuron viszerale dorsalen 4 (VD4) rekonstruiert und Links Pedal dorsal 1 (LPeD1), zeigen wir eine neue Form von kurzfristigen Potenzierung (STP) die &quot;Verwendung&quot; ist- aber nicht zeitabh&auml;ngig, im Gegensatz zu den meisten zuvor definierten Formen der kurzfristigen synaptische Plastizit&auml;t. Mit einer dreifach-Zelle-Konfiguration zeigen wir zum ersten Mal, dass ein einzelnes pr&auml;synaptischen Neuron zuverl&auml;ssig sowohl inhibitorische und exzitatorischen Synapsen potenzieren kann. Weiter zeigen wir, dass im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Formen von STP, die synaptische Potenzierung zwischen Lymnaea Neuronen keine postsynaptisches Rezeptor Sensibilisierung oder pr&auml;synaptische residual Kalzium herbeif&uuml;hrt. Schlie&szlig;lich bieten wir Beweise, dass STP bei der VD4-LPeD1-Synapse pr&auml;synaptische Calcium/Calmodulin-abh&auml;ngige Kinase II (CaMKII) erfordert. Zusammengenommen bezeichnet unserer Studie eine neue Form von STP die bilden die Basis f&uuml;r beide kurz- und langfristige Erm&ouml;glichung, da diesbez&uuml;glich keine Protein-Synthese-abh&auml;ngige Schritte, und CaMKII T&auml;tigkeit ausschlie&szlig;lich in der pr&auml;synaptischen Zelle beziehen kann.

Eine neue Form von pr&auml;synaptischen CaMKII-abh&auml;ngige kurzfristige Potenzierung zwischen Lymnaea Neuronen.

All excitable cell functions rely upon ion channels that are embedded in their plasma membrane. Perturbations of ion channel structure or function result in pathologies ranging from cardiac dysfunction to neurodegenerative disorders. Consequently, to understand the functions of excitable cells and to remedy their pathophysiology, it is important to understand the ion channel functions under various experimental conditions - including exposure to novel drug targets. Glass pipette patch-clamp is the state of the art technique to monitor the intrinsic and synaptic properties of neurons. However, this technique is labor intensive and has low data throughput. Planar patch-clamp chips, integrated into automated systems, offer high throughputs but are limited to isolated cells from suspensions, thus limiting their use in modeling physiological function. These chips are therefore not most suitable for studies involving neuronal communication. Multielectrode arrays (MEAs), in contrast, have the ability to monitor network activity by measuring local field potentials from multiple extracellular sites, but specific ion channel activity is challenging to extract from these multiplexed signals. Here we describe a novel planar patch-clamp chip technology that enables the simultaneous high-resolution electrophysiological interrogation of individual neurons at multiple sites in synaptically connected neuronal networks, thereby combining the advantages of MEA and patch-clamp techniques. Each neuron can be probed through an aperture that connects to a dedicated subterranean microfluidic channel. Neurons growing in networks are aligned to the apertures by physisorbed or chemisorbed chemical cues. In this review, we describe the design and fabrication process of these chips, approaches to chemical patterning for cell placement, and present physiological data from cultured neuronal cells.

From understanding cellular function to novel drug discovery: the role of planar patch-clamp array chip technology.

Alle erregbar Zelle Funktionen st&uuml;tzen sich auf Ionenkan&auml;le, die in ihrer Plasmamembran eingebettet sind. St&ouml;rungen von Ionen-Kanal-Struktur oder Funktion f&uuml;hren Pathologien von kardialen Dysfunktion bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen. Um die Funktionen von excitable Zellen zu verstehen und ihre Pathophysiologie zu beseitigen, ist es daher wichtig zu verstehen, die Ion-Kanalfunktionen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen - einschlie&szlig;lich der Gef&auml;hrdung durch neuartige Droge-Ziele. Glas-Pipette Patch-Clamp ist die modernste Technik, die intrinsischen und synaptischen Eigenschaften der Neuronen zu &uuml;berwachen. Aber diese Technik ist arbeitsintensiv und hat geringen Datendurchsatz. Planare Patch-Clamp-Chips, Automationen, integriert bieten hohe Durchs&auml;tze aber begrenzt an isolierten Zellen von Suspensionen, ihre Verwendung bei der Modellierung physiologische Funktion eingeschr&auml;nkt sind. Diese Chips sind daher nicht f&uuml;r Studien mit neuronalen Kommunikation am geeignetsten. Multielectrode Arrays (MEAs), im Gegensatz dazu haben die Netzwerk-Aktivit&auml;t &uuml;berwachen durch Messung lokales Feld Potenziale mehrerer extrazellul&auml;re Standorte, aber spezifische Ion Channel-Aktivit&auml;ten ist eine Herausforderung, um aus dieser Multiplex-Signale zu extrahieren. Hier beschreiben wir eine neuartige planare Patch-Clamp-Chip-Technologie, die es erm&ouml;glicht die gleichzeitige hochaufl&ouml;sende elektrophysiologische Befragung des einzelnen Neuronen an mehreren Standorten in synaptisch neuronale Netzwerke, damit kombinieren die Vorteile von MEA und Patch-Clamp-Technik. Jedes Neuron kann durch eine Blende sondiert werden, die einen dedizierten unterirdischen Microfluidic-Kanal verbindet. Neuronen wachsen in Netzwerken werden die &Ouml;ffnungen von Physisorbed oder chemisorbed chemische Signale ausgerichtet. In diesem Bericht beschreiben wir den Prozess-Design und Fertigung dieser Chips, Ans&auml;tze zur chemischen Musterung f&uuml;r Zelle Platzierung und physiologische Daten von kultivierten neuronalen Zellen.

Article	Year
An identified central pattern-generating neuron co-ordinates sensory-motor components of respiratory behavior in Lymnaea. The European journal of neuroscience\| PubMed ID: 16420419	2006
Peripheral oxygen-sensing cells directly modulate the output of an identified respiratory central pattern generating neuron. The European journal of neuroscience\| PubMed ID: 17610573	2007
Antidepressant fluoxetine suppresses neuronal growth from both vertebrate and invertebrate neurons and perturbs synapse formation between Lymnaea neurons. The European journal of neuroscience\| PubMed ID: 20377614	2010
A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons. Biotechnology and bioengineering\| PubMed ID: 20648547	2010
High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip. Biomedical microdevices\| PubMed ID: 20694518	2010
A novel approach reveals temporal patterns of synaptogenesis between the isolated growth cones of Lymnaea neurons. The European journal of neuroscience\| PubMed ID: 21039963	2010
Recordings of cultured neurons and synaptic activity using patch-clamp chips. Journal of neural engineering\| PubMed ID: 21540486	2011
A novel form of presynaptic CaMKII-dependent short-term potentiation between Lymnaea neurons. The European journal of neuroscience\| PubMed ID: 21749498	2011
From understanding cellular function to novel drug discovery: the role of planar patch-clamp array chip technology. Frontiers in pharmacology\| PubMed ID: 22007170	2011

Collin Luk

Biography

JoVE Journal Publications

Other Publications