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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

The discordance between steady-state levels of mRNAs and protein has been attributed to posttranscriptional control mechanisms affecting mRNA stability and translation. Traditional methods of genome wide microarray analysis, profiling steady-state levels of mRNA, may miss important mRNA targets owing to significant posttranscriptional gene regulation by RNA binding proteins (RBPs).

The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.

Die Diskordanz zwischen station&auml;ren mRNAs und Protein wurde auf Posttranscriptionale Kontrollmechanismen, die die Stabilit&auml;t der mRNA und &Uuml;bersetzung zur&uuml;ckgef&uuml;hrt. Traditionelle Methoden der Genom-breiten Microarray-Analyse, Profilerstellung station&auml;ren Ebenen der mRNA, k&ouml;nnen wichtige Ziele der mRNA aufgrund der erheblichen Posttranscriptionale Genregulation durch RNA-bindende Proteine (RBPs) verpasst.

Das RNA-verbindliches Protein HuR regelt differentiell eindeutigen Teilmengen von mRNAs &Ouml;strogen-Rezeptor-negativen und &Ouml;strogen-Rezeptor-positivem Brustkrebs.

Interactions between RNA binding proteins (RBPs) and genes are not well understood, especially in regulation of angiogenesis. The RBP HuR binds to the AU-rich (ARE) regions of labile mRNAs, facilitating their translation into protein and has been hypothesized to be a tumor-maintenance gene. Elevated levels of cytoplasmic HuR directly correlate with increased invasiveness and poor prognosis for many cancers, including those of the breast. HuR controls the expression of multiple genes involved in angiogenesis including VEGFÎ±, HIF1Î± and thrombospondin 1 (TSP1). We investigated the role of HuR in estrogen receptor negative (ER(-)) breast cancer. MDA-MB-231 cells with higher levels of HuR have alterations in cell cycle kinetics and faster growth. Unexpectedly, HuR overexpression significantly interfered with tumor growth in orthotopic mouse models. The putative mechanism seems to be an anti-angiogenetic effect by increasing expression of TSP1 but also surprisingly, downregulating VEGF, a target which HuR normally increases. Our findings reveal that HuR may be regulating a cluster of genes involved in blood vessel formation which controls tumor angiogenesis. An approach of modulating HuR levels may overcome limitations associated with monotherapies targeting tumor vessel formation.

Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.

Interaktionen zwischen RNA-bindende Proteine (RBPs) und Genen sind nicht gut, vor allem bei der Regulierung der Angiogenese verstanden. Die RBP-HuR bindet an den AU-Reich (ARE) Regionen zersetzliche mRNAs, erleichtern deren &Uuml;bersetzung in Proteine und hat um ein Tumor-Wartung-gen werden theoretisiert worden. Erh&ouml;hte Konzentrationen von zytoplasmatischen HuR korrelieren direkt mit erh&ouml;hter Invasivit&auml;t und schlechte Prognose bei vielen Krebsarten, einschlie&szlig;lich derjenigen der Brust. HuR steuert die Expression von mehreren Genen Angiogenese, einschlie&szlig;lich VEGF&alpha;, HIF1&alpha; und Thrombospondin 1 (TSP1) beteiligt. Wir untersuchten die Rolle der HuR &Ouml;strogen-Rezeptor-negativen (ER(-))-Brustkrebs. MDA-MB-231-Zellen mit h&ouml;herem HuR haben &Auml;nderungen in Zellzykluskinetik und schnelleres Wachstum. HuR &Uuml;berexpression mischte sich unerwartet deutlich mit Tumorwachstum in Orthotopic Mausmodelle. Der vermeintliche Mechanismus scheint eine Anti-Angiogenetic Wirkung durch die Erh&ouml;hung der Expression von TSP1 aber auch &uuml;berraschend Herunterregulierung VEGF, ein Ziel, das HuR normalerweise erh&ouml;ht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass HuR einen Cluster von Genen, die bei Blutgef&auml;&szlig;-Bildung regulieren kann die Tumorangiogenese steuert. Ein Ansatz der modulierenden HuR Ebenen kann Einschr&auml;nkungen zugeordnet Monotherapies Zielgruppenadressierung Schiff Tumorbildung &uuml;berwinden.

Eine &Uuml;berexpression von der RNA verbindliches Protein beeintr&auml;chtigt HuR Tumorwachstum in Dreifach negativem Brustkrebs mangelhaft Angiogenese zugeordnet.

The posttranscriptional mechanisms whereby RNA-binding proteins (RBPs) regulate T cell differentiation remain unclear. RBPs can coordinately regulate the expression of functionally related genes via binding to shared regulatory sequences, such as the adenylate-uridylate-rich elements (AREs) present in the 3' untranslated region (UTR) of mRNA. The RBP HuR posttranscriptionally regulates IL-4, IL-13, and other Th2 cell-restricted transcripts. We hypothesized that the ARE-bearing GATA-3 gene, a critical regulator of Th2 polarization, is under HuR control as part of its coordinate posttranscriptional regulation of the Th2 program. We report that in parallel with stimulus-induced increase in GATA-3 mRNA and protein levels, GATA-3 mRNA half-life is increased after restimulation in the human T cell line Jurkat, in human memory and Th2 cells, and in murine Th2-skewed cells. We demonstrate by immunoprecipitation of ribonucleoprotein complexes that HuR associates with the GATA-3 endogenous transcript in human T cells and found, using biotin pulldown assay, that HuR specifically interacts with its 3'UTR. Using both loss-of-function and gain-of-function approaches in vitro and in animal models, we show that HuR is a critical mediator of stimulus-induced increase in GATA-3 mRNA and protein expression and that it positively influences GATA-3 mRNA turnover, in parallel with selective promotion of Th2 cytokine overexpression. These results suggest that HuR-driven posttranscriptional control plays a significant role in T cell development and effector function in both murine and human systems. A better understanding of HuR-mediated control of Th2 polarization may have utility in altering allergic airway inflammation in human asthmatic patients.

Coordinate regulation of GATA-3 and Th2 cytokine gene expression by the RNA-binding protein HuR.

Die Posttranscriptionale Mechanismen, die bei dem RNA-bindende Proteine (RBPs) T-Zell-Differenzierung regulieren bleiben unklar. RBPs kann coordinately regulieren die Expression von verwandeten Genen &uuml;ber Bindung an gemeinsame regulatorische Sequenzen, wie z. B. die Adenylat-Uridylate-Reich-Elemente (AREs) in der 3&#39; un&uuml;bersetzte Region (UTR) der mRNA. Die RBP-HuR regelt posttranscriptionally IL-4, IL-13 und andere Th2-Zelle-eingeschr&auml;nkte-Transkripte. Wir die Hypothese, dass das sind tragende GATA-3 gen, ein wichtiger Regulator der Th2-Polarisation, als Teil seiner Koordinaten Posttranscriptionale Regulation des Programms Th2 HuR Kontrolle unterliegt. Wir berichten, dass parallel zu den Reiz-induzierten Anstieg GATA-3 mRNA und Protein, GATA-3 mRNA-Halbwertszeit nach Restimulation in der menschlichen T-Zell-Linie Jurkat, im menschlichen Ged&auml;chtnis und Th2 Zellen und in murinen verzerrt, Th2 Zellen erh&ouml;ht wird. Wir demonstrieren durch Immunopr&auml;zipitation-Gebiets-komplexe, die die GATA-3 endogene Abschrift in den menschlichen T-Zellen HuR zuordnet und gefunden, Biotin-Pulldown-Probe, die HuR, die speziell mit interagiert mit seiner 3&#39;UTR. Anhand der Verlustfunktion und Gain of Function Ans&auml;tze in vitro und in Tiermodellen zeigen wir, dass HuR ein kritischer Vermittler von Reiz-induzierte Zunahme GATA-3-mRNA und Protein-Expression und GATA-3 mRNA Umsatz, parallel zu selektive F&ouml;rderung von Th2 Cytokine &Uuml;berexpression positiv beeinflusst. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HuR-gesteuerte Posttranscriptionale Kontrolle eine bedeutende Rolle in T-Zell-Entwicklung und Effektor-Funktion sowohl murinen und menschliche Systeme spielt. Ein besseres Verst&auml;ndnis der HuR-vermittelte Kontrolle der Th2-Polarisierung m&ouml;glicherweise Dienstprogramm allergischen Atemwegsentz&uuml;ndung in menschlichen Asthma-Patienten zu &auml;ndern.

Article	Year
The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC cancer\| PubMed ID: 20370918	2010
Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell cycle (Georgetown, Tex.)\| PubMed ID: 20724828	2010
Coordinate regulation of GATA-3 and Th2 cytokine gene expression by the RNA-binding protein HuR. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950)\| PubMed ID: 21613615	2011

Joseph D. Magee

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