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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

To identify new diagnostic markers and drug targets for pancreatic cancer, we compared the gene expression patterns of pancreatic cancer cell lines growing in tissue culture with those of normal pancreas using cDNA microarray analysis. Fluorescently (cyanine 5) labeled cDNA probes, made individually from mRNA samples of nine pancreatic cell lines, were each combined with fluorescently (cyanine 3) labeled universal reference mRNA. The mixed probes of each sample were then hybridized with 5760 cDNA arrays (5289 unique cDNA sequences) printed on individual microscope slides. Fluorescently (cyanine 5) labeled normal pancreas mRNA was also compared with the same universal reference mRNA reference pool. The expression ratios of neoplastic versus normal pancreas cells were then calculated by multiplying the ratio of cancer versus the universal reference mRNA and the ratio of the universal reference mRNA cell versus normal pancreas. For 5289 different genes interrogated by the arrays, 30 of them showed an expression ratio 2 SD from the mean in at least three of the nine pancreatic cell lines studied. To confirm the expression profiles of these genes, quantitative reverse transcription-PCR and Northern blot were carried out for 25 of the overexpressed genes. To verify the overexpression in patient samples, two of the overexpressed genes, c-Myc and Rad51, were selected to undergo analysis by reverse transcription-PCR in frozen tumor tissues and by immunostaining in paraffin-embedded tissue section microarrays. The results of these experiments are in agreement with the microarray data. Potential up-regulated targets of note from this study include urokinase-type plasminogen activator receptor, serine/threonine kinase 15, thioredoxin reductase, and CDC28 protein kinase 2, as well as several others.

Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray.

Ermittlung neuer diagnostischer Marker und Droge-Ziele f&uuml;r Bauchspeicheldr&uuml;senkrebs, verglichen wir die Genausdruck Muster der pankreatischen Krebszelllinien w&auml;chst in Gewebekultur mit denen der normalen Bauchspeicheldr&uuml;se mithilfe von cDNA-Microarray-Analyse. Leuchtstoff (Cyanine 5) beschriftet DNA-Sonden, individuell aus mRNA Proben von neun Pankreas Zelllinien hergestellt, wurden jeweils in Kombination mit fluorescently (Cyanine 3) gekennzeichneten universelle verweisen mRNA. Die gemischten Sonden jeder Probe wurden dann mit 5760 cDNA-Arrays (5289 einzigartigen DNA-Sequenzen), gedruckt auf einzelne Objekttr&auml;ger hybridisiert. Leuchtstoff (Cyanine 5) gekennzeichneten normalen Bauchspeicheldr&uuml;se mRNA auch mit dem gleichen universellen Verweis mRNA Verweis Pool verglichen wurde. Die Ausdruck-Verh&auml;ltnisse von neoplastischen gegen&uuml;ber normalen Bauchspeicheldr&uuml;se, die Zellen dann errechnet wurden, multipliziert das Verh&auml;ltnis von Krebs im Vergleich zu dem universellen mRNA und das Verh&auml;ltnis von der universal Bezugszelle mRNA im Vergleich zu normalen Bauchspeicheldr&uuml;se verweisen. 5289 Verschiedene Gene von Arrays verh&ouml;rt studierte 30 davon zeigte einen Ausdruck Verh&auml;ltnis 2 SD vom Mittelwert in mindestens drei der neun Pankreas-Zelllinien. Um die Profile der Ausdruck dieser Gene zu best&auml;tigen, wurden quantitative reverse Transkription-PCR und Nordfleck f&uuml;r 25 der &uuml;berexprimiert Gene durchgef&uuml;hrt. &Uuml;berpr&uuml;fen Sie die &Uuml;berexpression in Patientenproben, wurden zwei der &uuml;berexprimiert Gene, c-Myc und Rad51, ausgew&auml;hlt durch reverse Transkription-PCR in fixierten Tumor Gewebe und Paraffinschnitten in Paraffin-eingebetteten Gewebe Abschnitt Microarrays Analyse zu unterziehen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind im Einvernehmen mit der Microarray-Daten. M&ouml;gliche oben-geregelt-Ziele der Hinweis aus dieser Studie geh&ouml;ren Urokinase-Typ Plasminogen-Aktivator-Rezeptor, Serin/Threonin-Kinase 15, Thioredoxin-Reduktase, und CDC28-Proteinkinase 2, sowie einige andere.

Kennung der differentiell exprimierten Genen in Bauchspeicheldr&uuml;senkrebs Zellen mit DNA Microarray.

Interactions between extracellular matrix proteins and prostate carcinoma cells change dramatically during prostate tumor progression. We have concentrated on two key modifications that occur in the hemidesmosome in prostate carcinoma: loss of laminin-5 protein expression and altered basal cell polarity of the alpha6beta4 integrin. We previously demonstrated two cell line-specific isoforms (beta3A and beta3B) of the LAMB3 message. Cells expressing only the beta3B isoform did not translate the beta3 protein and were unable to assemble the laminin-5 trimer. One such cell line, LNCaP, was selected to determine whether restoration of the laminin-5 beta3A isoform would cause expression of a functional laminin-5 beta3 chain, assembly and secretion of the laminin-5 trimer, and reversion to a non-neoplastic phenotype. Laminin-5 beta3A cDNA was cloned and stably transfected into LNCaP cells. We observed the restoration of the beta3 protein, but a laminin-5 trimer was not secreted. Moreover, increased cell migration was demonstrated, and tumorigenicity was increased in SCID mice. A microarray analysis, performed between transfected and nontransfected LNCaP cells, showed most changing genes to be associated with signal transduction. The beta3 chain of laminin-5 may thus play an important role in signal transduction, which may enhance cell motility and tumorigenesis.

Laminin-5 beta3A expression in LNCaP human prostate carcinoma cells increases cell migration and tumorigenicity.

Wechselwirkungen zwischen Proteinen der extrazellul&auml;ren Matrix und Prostata-Karzinom-Zellen drastisch ver&auml;ndern, w&auml;hrend der Prostata Tumor Fortschreiten. Wir konzentrierten sich auf zwei wichtige &Auml;nderungen, die in dem Hemidesmosom in Prostatakarzinom auftreten: Verlust von Laminin-5 Proteinexpression und ver&auml;nderte Basalzell-Polarit&auml;t der alpha6beta4-Integrin. Wir bewiesen zuvor zwei Zelle Zeile-spezifische Isoformen (beta3A und beta3B) der LAMB3 Nachricht. Zellen, die nur die beta3B-Isoform auszudr&uuml;cken nicht &uuml;bersetzen, das beta3-Protein und konnten die Laminin-5-Trimer zusammenzubauen. Eine solche Zelle Zeile, LNCaP, wurde ausgew&auml;hlt, um festzustellen, ob die Wiederherstellung von Laminin-5 beta3A-Isoform Ausdruck eine funktionale Laminin-5 beta3-Kette, die Montage und die Sekretion von Laminin-5 Trimer und R&uuml;ckfall in eine nicht-neoplastischen Ph&auml;notyps f&uuml;hren w&uuml;rde. Laminin-5 beta3A cDNA wurde geklont und stabil die transfected in LNCaP Zellen. Wir beobachteten die Wiederherstellung des Proteins beta3, aber ein Trimer Laminin-5 wurde nicht abgesondert. Dar&uuml;ber hinaus war erh&ouml;hte Zellmigration, und Tumorigenicity SCID-M&auml;usen erh&ouml;ht wurde. Ein Microarray Analysen zwischen transfizierte und nontransfected LNCaP Zellen, zeigten die meisten wandelnden Gene Signaltransduktion zugeordnet werden. Die beta3-Kette von Laminin-5 kann somit eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion, spielen die Zelle Motilit&auml;t und Tumorigenese verbessern kann.

Laminin-5 beta3A Ausdruck in LNCaP menschlichen Prostata-Karzinom-Zellen erh&ouml;ht die Zellmigration und Tumorigenicity.

In prostate cancer progression, the basal lamina switches from predominantly laminin-5 to laminin-10. DU-145 prostate cancer cells were treated with either soluble laminin-5 (20 ng/ml) or laminin-10 (1 microg/ml) for 6, 24, and 48 hr. Total RNA was harvested for a 7,500 human cDNA microarray. Hybridizations were carried out in accordance with a 10 sample analysis of variance (ANOVA) statistical model. One thousand one hundred sixteen genes had measurable expression 2 standard deviations above background and 50% of spots for any given sample for all hybridizations were positive. Expression values of significantly varying genes were clustered and a list of 408 genes (P < 0.05) with a 1.5 or greater fold change in at least one time point were chosen for further analysis. Seventy eight changed in a time-dependent manner with laminin-10 treatment, 85 changed with laminin-5, and 13 showed changes with both treatments. The 408 genes that passed a paired t-test in at least one time-dependent category were further analyzed using Pathway Miner. One of the largest gene association networks involved signal transduction in the growth factor-MAP kinase pathways. EGFR was validated by real-time PCR and laminin-10 mediated cell adhesion activated EGFR in DU-145 cells. Both laminins appear to be important signal transducers in prostate cancer.

Human laminin-5 and laminin-10 mediated gene expression of prostate carcinoma cells.

Im Fortschreiten der Prostatakrebs wechselt die Basallamina Laminin-10 von &uuml;berwiegend Laminin-5. DU-145 Prostatakrebszellen mit entweder l&ouml;slich Laminin-5 (20 ng/ml) behandelt wurden, oder Laminin-10 (1 &micro;g/ml) f&uuml;r 6, 24 und 48 Std. Total RNA wurde f&uuml;r ein 7.500 menschlichen cDNA-Microarray geerntet. Hybridisierung wurden gem&auml;&szlig; eines statistischen Modells der 10 Beispiel Varianzanalyse (ANOVA) durchgef&uuml;hrt. Ein tausend ein hundert sechzehn Gene hatte messbarer Ausdruck 2 Standardabweichungen &uuml;ber Hintergrund und 50 % der Spots f&uuml;r jede gegebene Beispiel f&uuml;r alle Hybridisierung waren positiv. Ausdruckswerte deutlich unterschiedlicher Gene waren damals und eine Liste von 408 Gene (P &lt; 0,05) mit 1,5 oder gr&ouml;&szlig;er Faltung wurden Ver&auml;nderungen in mindestens einem Punkt zur weiteren Analyse ausgew&auml;hlt. Siebzig acht in einer zeitabh&auml;ngigen Weise mit Laminin-10 Behandlung, 85 ge&auml;ndert mit Laminin-5 und 13 zeigte Ver&auml;nderungen mit beiden Behandlungen ver&auml;ndert. Die 408 Gene, die einen gepaarten t-Test mindestens eine zeitabh&auml;ngige Kategorie &uuml;bergeben wurden weiter mit Pathway Miner analysiert. Eines der gr&ouml;&szlig;ten gen Verband Netzwerke beteiligt Signaltransduktion in den Wachstumsfaktor-MAP-Kinase-Pfaden. EGFR wurde durch Echtzeit-PCR &uuml;berpr&uuml;ft und Laminin-10 vermittelte Zelladh&auml;sion aktiviert EGFR in DU-145 Zellen. Beide Laminins erscheinen wichtiges Signal-Wandler bei Prostatakrebs.

Menschliche Laminin-5 und Laminin-10 vermittelten Genexpression von Prostata-Karzinom-Zellen.

Safe and efficient endoscopic closure of a colotomy is essential for transcolonic peritoneal access or endoscopic full-thickness resection of the colon, if open or laparoscopic surgery is to be avoided.

Endoscopic colotomy closure for natural orifice transluminal endoscopic surgery using a T-fastener prototype in comparison to conventional laparoscopic suture closure.

Sichere und effiziente endoskopische Schlie&szlig;ung der ein Colotomy ist notwendig f&uuml;r Transcolonic peritonealen Zugang bzw. endoskopische voll-Dicke Resektion des Dickdarms, wenn offene oder Laparoskopische Chirurgie verhindert werden soll.

Endoskopische Colotomy Verschluss f&uuml;r nat&uuml;rliche K&ouml;rper&ouml;ffnung transluminale endoskopische Chirurgie mit einem T-Verbindungselement Prototype im Vergleich zu konventionellen laparoskopischen Naht Schlie&szlig;ung.

Safe and efficient gastrotomy creation and closure is pivotal for natural orifice transluminal endoscopic surgery (NOTES).

Gastrotomy creation and closure for NOTES using a gastropexy technique (with video).

Sichere und effiziente Gastrostomie Gr&uuml;ndung und Schlie&szlig;ung ist von zentraler Bedeutung f&uuml;r die nat&uuml;rliche K&ouml;rper&ouml;ffnung transluminale endoskopische Chirurgie (Anmerkungen).

Gastrostomie Erstellung und Verschluss f&uuml;r NOTES mit einer Gastropexy-Technik (mit Video).

This study aimed to evaluate the effect of two different sterilization protocols on the bacterial counts in the swine colon as preparation for natural orifice translumenal endoscopic surgery (NOTES) surgery.

Colonic sterilization for natural orifice translumenal endoscopic surgery (NOTES) procedures: a comparison of two decontamination protocols.

Diese Studie zielte darauf ab, die Wirkung von zwei verschiedenen Sterilisation Protokolle auf die bakterielle bewerten z&auml;hlt in den Schweine-Darm als Vorbereitung f&uuml;r nat&uuml;rliche K&ouml;rper&ouml;ffnung Translumenal endoskopische Chirurgie (NOTES) Chirurgie.

Kolon Sterilisation f&uuml;r nat&uuml;rliche K&ouml;rper&ouml;ffnung Translumenal endoskopische Chirurgie (NOTES) Verfahren: ein Vergleich der beiden Dekontamination-Protokolle.

The discordance between steady-state levels of mRNAs and protein has been attributed to posttranscriptional control mechanisms affecting mRNA stability and translation. Traditional methods of genome wide microarray analysis, profiling steady-state levels of mRNA, may miss important mRNA targets owing to significant posttranscriptional gene regulation by RNA binding proteins (RBPs).

The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.

Die Diskordanz zwischen station&auml;ren mRNAs und Protein wurde auf Posttranscriptionale Kontrollmechanismen, die die Stabilit&auml;t der mRNA und &Uuml;bersetzung zur&uuml;ckgef&uuml;hrt. Traditionelle Methoden der Genom-breiten Microarray-Analyse, Profilerstellung station&auml;ren Ebenen der mRNA, k&ouml;nnen wichtige Ziele der mRNA aufgrund der erheblichen Posttranscriptionale Genregulation durch RNA-bindende Proteine (RBPs) verpasst.

Das RNA-verbindliches Protein HuR regelt differentiell eindeutigen Teilmengen von mRNAs &Ouml;strogen-Rezeptor-negativen und &Ouml;strogen-Rezeptor-positivem Brustkrebs.

Interactions between RNA binding proteins (RBPs) and genes are not well understood, especially in regulation of angiogenesis. The RBP HuR binds to the AU-rich (ARE) regions of labile mRNAs, facilitating their translation into protein and has been hypothesized to be a tumor-maintenance gene. Elevated levels of cytoplasmic HuR directly correlate with increased invasiveness and poor prognosis for many cancers, including those of the breast. HuR controls the expression of multiple genes involved in angiogenesis including VEGFÎ±, HIF1Î± and thrombospondin 1 (TSP1). We investigated the role of HuR in estrogen receptor negative (ER(-)) breast cancer. MDA-MB-231 cells with higher levels of HuR have alterations in cell cycle kinetics and faster growth. Unexpectedly, HuR overexpression significantly interfered with tumor growth in orthotopic mouse models. The putative mechanism seems to be an anti-angiogenetic effect by increasing expression of TSP1 but also surprisingly, downregulating VEGF, a target which HuR normally increases. Our findings reveal that HuR may be regulating a cluster of genes involved in blood vessel formation which controls tumor angiogenesis. An approach of modulating HuR levels may overcome limitations associated with monotherapies targeting tumor vessel formation.

Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.

Interaktionen zwischen RNA-bindende Proteine (RBPs) und Genen sind nicht gut, vor allem bei der Regulierung der Angiogenese verstanden. Die RBP-HuR bindet an den AU-Reich (ARE) Regionen zersetzliche mRNAs, erleichtern deren &Uuml;bersetzung in Proteine und hat um ein Tumor-Wartung-gen werden theoretisiert worden. Erh&ouml;hte Konzentrationen von zytoplasmatischen HuR korrelieren direkt mit erh&ouml;hter Invasivit&auml;t und schlechte Prognose bei vielen Krebsarten, einschlie&szlig;lich derjenigen der Brust. HuR steuert die Expression von mehreren Genen Angiogenese, einschlie&szlig;lich VEGF&alpha;, HIF1&alpha; und Thrombospondin 1 (TSP1) beteiligt. Wir untersuchten die Rolle der HuR &Ouml;strogen-Rezeptor-negativen (ER(-))-Brustkrebs. MDA-MB-231-Zellen mit h&ouml;herem HuR haben &Auml;nderungen in Zellzykluskinetik und schnelleres Wachstum. HuR &Uuml;berexpression mischte sich unerwartet deutlich mit Tumorwachstum in Orthotopic Mausmodelle. Der vermeintliche Mechanismus scheint eine Anti-Angiogenetic Wirkung durch die Erh&ouml;hung der Expression von TSP1 aber auch &uuml;berraschend Herunterregulierung VEGF, ein Ziel, das HuR normalerweise erh&ouml;ht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass HuR einen Cluster von Genen, die bei Blutgef&auml;&szlig;-Bildung regulieren kann die Tumorangiogenese steuert. Ein Ansatz der modulierenden HuR Ebenen kann Einschr&auml;nkungen zugeordnet Monotherapies Zielgruppenadressierung Schiff Tumorbildung &uuml;berwinden.

Eine &Uuml;berexpression von der RNA verbindliches Protein beeintr&auml;chtigt HuR Tumorwachstum in Dreifach negativem Brustkrebs mangelhaft Angiogenese zugeordnet.

The posttranscriptional mechanisms whereby RNA-binding proteins (RBPs) regulate T cell differentiation remain unclear. RBPs can coordinately regulate the expression of functionally related genes via binding to shared regulatory sequences, such as the adenylate-uridylate-rich elements (AREs) present in the 3' untranslated region (UTR) of mRNA. The RBP HuR posttranscriptionally regulates IL-4, IL-13, and other Th2 cell-restricted transcripts. We hypothesized that the ARE-bearing GATA-3 gene, a critical regulator of Th2 polarization, is under HuR control as part of its coordinate posttranscriptional regulation of the Th2 program. We report that in parallel with stimulus-induced increase in GATA-3 mRNA and protein levels, GATA-3 mRNA half-life is increased after restimulation in the human T cell line Jurkat, in human memory and Th2 cells, and in murine Th2-skewed cells. We demonstrate by immunoprecipitation of ribonucleoprotein complexes that HuR associates with the GATA-3 endogenous transcript in human T cells and found, using biotin pulldown assay, that HuR specifically interacts with its 3'UTR. Using both loss-of-function and gain-of-function approaches in vitro and in animal models, we show that HuR is a critical mediator of stimulus-induced increase in GATA-3 mRNA and protein expression and that it positively influences GATA-3 mRNA turnover, in parallel with selective promotion of Th2 cytokine overexpression. These results suggest that HuR-driven posttranscriptional control plays a significant role in T cell development and effector function in both murine and human systems. A better understanding of HuR-mediated control of Th2 polarization may have utility in altering allergic airway inflammation in human asthmatic patients.

Coordinate regulation of GATA-3 and Th2 cytokine gene expression by the RNA-binding protein HuR.

Die Posttranscriptionale Mechanismen, die bei dem RNA-bindende Proteine (RBPs) T-Zell-Differenzierung regulieren bleiben unklar. RBPs kann coordinately regulieren die Expression von verwandeten Genen &uuml;ber Bindung an gemeinsame regulatorische Sequenzen, wie z. B. die Adenylat-Uridylate-Reich-Elemente (AREs) in der 3&#39; un&uuml;bersetzte Region (UTR) der mRNA. Die RBP-HuR regelt posttranscriptionally IL-4, IL-13 und andere Th2-Zelle-eingeschr&auml;nkte-Transkripte. Wir die Hypothese, dass das sind tragende GATA-3 gen, ein wichtiger Regulator der Th2-Polarisation, als Teil seiner Koordinaten Posttranscriptionale Regulation des Programms Th2 HuR Kontrolle unterliegt. Wir berichten, dass parallel zu den Reiz-induzierten Anstieg GATA-3 mRNA und Protein, GATA-3 mRNA-Halbwertszeit nach Restimulation in der menschlichen T-Zell-Linie Jurkat, im menschlichen Ged&auml;chtnis und Th2 Zellen und in murinen verzerrt, Th2 Zellen erh&ouml;ht wird. Wir demonstrieren durch Immunopr&auml;zipitation-Gebiets-komplexe, die die GATA-3 endogene Abschrift in den menschlichen T-Zellen HuR zuordnet und gefunden, Biotin-Pulldown-Probe, die HuR, die speziell mit interagiert mit seiner 3&#39;UTR. Anhand der Verlustfunktion und Gain of Function Ans&auml;tze in vitro und in Tiermodellen zeigen wir, dass HuR ein kritischer Vermittler von Reiz-induzierte Zunahme GATA-3-mRNA und Protein-Expression und GATA-3 mRNA Umsatz, parallel zu selektive F&ouml;rderung von Th2 Cytokine &Uuml;berexpression positiv beeinflusst. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HuR-gesteuerte Posttranscriptionale Kontrolle eine bedeutende Rolle in T-Zell-Entwicklung und Effektor-Funktion sowohl murinen und menschliche Systeme spielt. Ein besseres Verst&auml;ndnis der HuR-vermittelte Kontrolle der Th2-Polarisierung m&ouml;glicherweise Dienstprogramm allergischen Atemwegsentz&uuml;ndung in menschlichen Asthma-Patienten zu &auml;ndern.

Article	Year
Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer research\| PubMed ID: 12019169	2002
Laminin-5 beta3A expression in LNCaP human prostate carcinoma cells increases cell migration and tumorigenicity. Neoplasia (New York, N.Y.)\| PubMed ID: 15548355	2004
Human laminin-5 and laminin-10 mediated gene expression of prostate carcinoma cells. The Prostate\| PubMed ID: 16804886	2006
Endoscopic colotomy closure for natural orifice transluminal endoscopic surgery using a T-fastener prototype in comparison to conventional laparoscopic suture closure. Gastrointestinal endoscopy\| PubMed ID: 18534584	2008
Gastrotomy creation and closure for NOTES using a gastropexy technique (with video). Gastrointestinal endoscopy\| PubMed ID: 18599054	2008
Colonic sterilization for natural orifice translumenal endoscopic surgery (NOTES) procedures: a comparison of two decontamination protocols. Surgical endoscopy\| PubMed ID: 19118416	2009
The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC cancer\| PubMed ID: 20370918	2010
Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell cycle (Georgetown, Tex.)\| PubMed ID: 20724828	2010
Coordinate regulation of GATA-3 and Th2 cytokine gene expression by the RNA-binding protein HuR. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950)\| PubMed ID: 21613615	2011

Robert Calaluce

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