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Preparation of <em>Drosophila</em> Central Neurons for <em>in situ</em> Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Ionic currents underlie the firing patterns, excitability, and synaptic integration of neurons. Despite complete sequence information in multiple species, our knowledge about ion channel function in central neurons remains incomplete. This study analyzes the potassium currents of an identified Drosophila flight motoneuron, MN5, in situ. MN5 exhibits four different potassium currents, two fast-activating transient ones and two sustained ones, one of each is calcium activated. Pharmacological and genetic manipulations unravel the specific contributions of Shaker and Shal to the calcium independent transient A-type potassium currents. alpha-dendrotoxin (Shaker specific) and phrixotoxin-2 (Shal specific) block different portions of the transient calcium independent A-type potassium current. Following targeted expression of a Shaker dominant negative transgene in MN5, the remaining A-type potassium current is alpha-dendrotoxin insensitive. In Shal RNAi knock down the remaining A-type potassium current is phrixotoxin-2 insensitive. Additionally, barium blocks calcium-activated potassium currents but also a large portion of phrixotoxin-2-sensitive A-type currents. Targeted knock down of Shaker or Shal channels each cause identical reduction in total potassium current amplitude as acute application of alpha-dendrotoxin or phrixotoxin-2, respectively. This shows that the knock downs do not cause upregulation of potassium channels underlying other A-type channels during development. Immunocytochemistry and targeted expression of modified GFP-tagged Shaker channels with intact targeting sequence in MN5 indicate predominant axonal localization. These data can now be used to investigate the roles of Shaker and Shal for motoneuron intrinsic properties, synaptic integration, and spiking output during behavior by targeted genetic manipulations.

Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron.

Ionische Str&ouml;mungen zugrunde liegen, die feuern Muster, Erregbarkeit und synaptische Integration von Neuronen. Trotz komplette Sequenzinformationen auf mehrere Arten ist unser Wissen &uuml;ber Ionen-Kanal-Funktion in zentralen Neuronen unvollst&auml;ndig. Diese Studie analysiert die Kalium-Str&ouml;me von einem identifizierten Drosophila Flug Motoneuron, MN5, in-situ. MN5 Exponate vier verschiedene Kalium Str&ouml;me, zwei schnell-Aktivierung Transienten und beiden nachhaltig sind, ist jeweils eine Kalzium aktiviert. Pharmakologische und genetische Manipulationen zu entwirren die spezifischen Beitr&auml;ge von Shaker und Shal Kalzium unabh&auml;ngige transient Typ A Kalium Str&ouml;mungen. Alpha-Dendrotoxin (Shaker-spezifisch) und Phrixotoxin-2 (Shal-spezifisch) blockieren verschiedene Teile der transienten Kalzium unabh&auml;ngige Typ A Kalium aktuelle. Die restlichen Typ A Kalium aktuelle ist nach gezielten Ausdruck einen Shaker dominierenden negativen Transgene in MN5 Alpha-Dendrotoxin unempfindlich. In Shal RNAi Knock down die restlichen Typ ist Kalium aktuelle Phrixotoxin-2 unempfindlich. Dar&uuml;ber hinaus blockiert Barium, Kalzium aktivierte Kalium Str&ouml;me, sondern auch einen gro&szlig;en Teil der Phrixotoxin-2-Sensitive Typ A Str&ouml;mungen. Gezielte Knock down Shaker oder Shal Kan&auml;le bzw. jede Ursache identisch R&uuml;ckgang insgesamt Kalium aktuelle Amplitude als akute Anwendung von Alpha-Dendrotoxin oder Phrixotoxin-2. Dies zeigt, dass die Knock-Downs Hochregulation von Kaliumkan&auml;len zugrunde liegenden anderen Typ A-Kan&auml;le, w&auml;hrend der Entwicklung nicht bewirken. Immunzytochemie und gezielte Ausdruck ge&auml;ndert GFP markiert Shaker Kan&auml;le mit intakten Zielgruppenadressierung Sequenz in MN5 vorherrschende axonale Lokalisierung anzugeben. Diese Daten k&ouml;nnen nun die Rollen von Shaker und Shal Motoneuron inh&auml;renten Eigenschaften und synaptische Integration spiking Ausgabe w&auml;hrend Verhalten untersuchen durch gezielte genetische Manipulationen verwendet werden.

Shaker und Shal vermitteln transient Kalzium-unabh&auml;ngige Kalium Strom in eine Drosophila-Flug-Motoneuron.

Neuronal calcium acts as a charge carrier during information processing and as a ubiquitous intracellular messenger. Calcium signals are fundamental to numerous aspects of neuronal development and plasticity. Specific and independent regulation of these vital cellular processes is achieved by a rich bouquet of different calcium signaling mechanisms within the neuron, which either can operate independently or may act in concert. This study demonstrates the existence of a novel calcium signaling mechanism by simultaneous patch clamping and calcium imaging from acutely isolated central neurons. These neurons possess a membrane voltage sensor that, independent of calcium influx, causes G-protein activation, which subsequently leads to calcium release from intracellular stores via phospholipase C and inositol 1,4,5-trisphosphate receptor activation. This allows neurons to monitor activity by intracellular calcium release without relying on calcium as the input signal and opens up new insights into intracellular signaling, developmental regulation, and information processing in neuronal compartments lacking calcium channels.

Expanding the neuron's calcium signaling repertoire: intracellular calcium release via voltage-induced PLC and IP3R activation.

Neuronale Kalzium dient als ein Ladungstr&auml;ger w&auml;hrend der Informationsverarbeitung und als allgegenw&auml;rtige intrazellul&auml;re Bote. Calcium-Signale sind zahlreiche Aspekte der neuronalen Entwicklung und Plastizit&auml;t. Spezifische und unabh&auml;ngige Regulierung der diese wichtige zellul&auml;re Prozesse wird erreicht, indem ein reichen Bouquet von verschiedenen Kalzium Signalisierung Mechanismen innerhalb der Neuronen, die unabh&auml;ngig voneinander arbeiten k&ouml;nnen oder im Konzert fungieren kann. Diese Studie zeigt die Existenz von Roman Kalzium-Mechanismus durch gleichzeitige Patch Spannen und Kalzium Imaging von akut isoliert zentralen Neuronen signalisieren. Diese Neuronen besitzen ein Membran-Spannungssensor, unabh&auml;ngig von Kalzium Zustrom, Ursachen G-Protein-Aktivierung, die sp&auml;ter zur Freisetzung von Kalzium aus intrazellul&auml;ren speichern &uuml;ber Phospholipase C und Inosit 1,4,5-Trisphosphate-Aktivierung f&uuml;hrt. Dadurch k&ouml;nnen Nervenzellen Aktivit&auml;t durch intrazellul&auml;re Kalzium Freisetzung zu &uuml;berwachen, ohne auf Kalzium als das Eingangssignal und er&ouml;ffnet neue Einblicke in des intrazellul&auml;ren Signalisierens, entwicklungsbedingte Regulierung und Informationsverarbeitung in neuronalen F&auml;cher fehlt Kalzium-Kan&auml;le.

Das Neuron Kalzium Signalisierung Repertoire erweitern: intrazellul&auml;re Kalzium Freigabe &uuml;ber Spannung induziert PLC und IP3R-Aktivierung.

Dendrites are the fundamental determinant of neuronal wiring. Consequently dendritic defects are associated with numerous neurological diseases and mental retardation. Neuronal activity can have profound effects on dendritic structure, but the mechanisms controlling distinct aspects of dendritic architecture are not fully understood. We use the Drosophila genetic model system to test the effects of altered intrinsic excitability on postembryonic dendritic architecture development. Targeted dominant negative knock-downs of potassium channel subunits allow for selectively increasing the intrinsic excitability of a selected subset of motoneurons, whereas targeted expression of a genetically modified noninactivating potassium channel decrease intrinsic excitability in vivo. Both manipulations cause significant dendritic overgrowth, but by different mechanisms. Increased excitability causes increased dendritic branch formation, whereas decreased excitability causes increased dendritic branch elongation. Therefore dendritic branching and branch elongation are controlled by separate mechanisms that can be addressed selectively in vivo by different manipulations of neuronal intrinsic excitability.

Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability.

Dendriten sind die grundlegende Determinante der neuronalen Verdrahtung. Folglich sind dendritische M&auml;ngel verbunden mit zahlreichen neurologischen Erkrankungen und geistiger Retardierung. Neuronaler Aktivit&auml;t kann tiefgreifende Auswirkungen auf dendritische Struktur haben, aber die Mechanismen Steuern unterschiedliche Aspekte der dendritischen Architektur sind nicht vollst&auml;ndig verstanden. Wir verwenden Drosophila genetischen Modellsystem, um die Auswirkungen der ver&auml;nderten intrinsischen Erregbarkeit auf postembryonic dendritische Architektur-Entwicklung zu testen. Gezielte dominante negative Knock-Downs der Kaliumkanal, den Untereinheiten selektiv erh&ouml;hen die systeminterne Erregbarkeit einer ausgew&auml;hlten Teilmenge des Motoneurons, erm&ouml;glichen w&auml;hrend gezielte Expression von einer genetisch ver&auml;nderten noninactivating Kaliumkanal verringern in-vivo systeminterne Erregbarkeit. Beide Manipulationen verursachen erhebliche dendritische &uuml;berm&auml;&szlig;iges Wachstum, sondern durch verschiedene Mechanismen. Erh&ouml;hte Erregbarkeit f&uuml;hrt erh&ouml;hte dendritische Verzweigung Bildung, hingegen verminderte Erregbarkeit erh&ouml;hte dendritische Verzweigung Dehnung verursacht. Daher sind dendritische Verzweigung und Branch Dehnung durch separate Mechanismen gesteuert, die durch verschiedene Manipulationen der neuronalen Erregbarkeit der systeminternen selektiv in-vivo bew&auml;ltigt werden k&ouml;nnen.

Dendrit Dehnung und dendritischer Verzweigungen sind getrennt durch unterschiedliche Formen der systeminternen Motoneuron Erregbarkeit betroffen.

Different blends of membrane currents underlie distinct functions of neurons in the brain. A major step towards understanding neuronal function, therefore, is to identify the genes that encode different ionic currents. This study combined in situ patch clamp recordings of somatodendritic calcium currents in an identified adult Drosophila motoneuron with targeted genetic manipulation. Voltage clamp recordings revealed transient low voltage-activated (LVA) currents with activation between â€“60 mV and â€“70 mV as well as high voltage-activated (HVA) current with an activation voltage around â€“30 mV. LVA could be fully inactivated by prepulses to â€“50 mV and was partially amiloride sensitive. Recordings from newly generated mutant flies demonstrated that DmÎ±G (Ca(v)3 homolog) encoded the amiloride-sensitive portion of the transient LVA calcium current. We further demonstrated that the Ca(v)2 homolog, Dmca1A, mediated the amiloride-insensitive component of LVA current. This novel role of Ca(v)2 channels was substantiated by patch clamp recordings from conditional mutants, RNAi knock-downs, and following Dmca1A overexpression. In addition, we show that Dmca1A underlies the HVA somatodendritic calcium currents in vivo. Therefore, the Drosophila Ca(v)2 homolog, Dmca1A, underlies HVA and LVA somatodendritic calcium currents in the same neuron. Interestingly, DmÎ±G is required for regulating LVA and HVA derived from Dmca1A in vivo. In summary, each vertebrate gene family for voltage-gated calcium channels is represented by a single gene in Drosophila, namely Dmca1D (Ca(v)1), Dmca1A (Ca(v)2) and DmÎ±G (Ca(v)3), but the commonly held view that LVA calcium currents are usually mediated by Ca(v)3 rather than Ca(v)2 channels may require reconsideration.

Ca(v)2 channels mediate low and high voltage-activated calcium currents in Drosophila motoneurons.

Unterschiedliche Mischungen der Membran Str&ouml;me liegen eindeutige Funktionen von Neuronen im Gehirn zugrunde. Ein wichtiger Schritt in Richtung zum Verst&auml;ndnis der neuronalen Funktion ist daher, die Gene zu identifizieren, die verschiedene Ionische Str&ouml;mungen zu codieren. Diese Studie kombinierte in-situ Patch Clamp Aufnahmen Somatodendritic Kalzium Str&ouml;me in einem identifizierten Erwachsener Taufliege Motoneuron mit gezielten Genmanipulation. Spannung Klemme Aufnahmen zeigte transient niedrige Spannung aktiviert (LVA) Str&ouml;mungen mit Aktivierung zwischen-60 mV und-70 mV sowie hohe Spannung aktiviert (HVA) Strom mit einer Spannung um-30 mV. LVA konnte vollst&auml;ndig inaktiviert werden, von Prepulses bis &ndash; 50 mV und war teilweise Amilorids empfindlich. Aufnahmen von den neu generierten mutant fliegen nachgewiesen wird, dass Dm&alpha;G (Ca (V) 3 Homolog) codiert den Amilorids-Sensitive Teil des aktuellen transient LVA Kalziums. Wir zeigte ein weiteres Mal, dass die Zertifizierungsstelle (V) 2 Homolog, Dmca1A, vermittelt die Amilorids-unempfindliche-Komponente der LVA-Strom. Diese neuartige Rolle der Ca (V) 2 Kan&auml;le vom Patch Clamp Aufnahmen von bedingten Mutanten, RNAi Knock-out-tiefen und folgenden Dmca1A eine &Uuml;berexpression begr&uuml;ndet wurde. Dar&uuml;ber hinaus zeigen wir, dass Dmca1A die HVA Somatodendritic Kalzium Str&ouml;me in-vivo zugrunde liegt. Daher der Drosophila-Ca (V) 2 Homolog, Dmca1A, zugrunde liegt, HVA und LVA Somatodendritic Kalzium Str&ouml;me in der gleichen Neuron. Interessanterweise ist die Dm&alpha;G f&uuml;r die Regulierung der LVA und HVA, abgeleitet von Dmca1A in-vivo erforderlich. Zusammenfassend l&auml;sst sich sagen, jedes Wirbeltier-gen-Familie f&uuml;r Spannung-Gating Kalzium-Kan&auml;le ist vertreten durch ein einzelnes Gen in Drosophila, n&auml;mlich Dmca1D (Ca(v)1), Dmca1A (Ca(v)2) und Dm&alpha;G (Ca(v)3), aber die allgemein verbreitete Ansicht, dass die LVA Kalzium Str&ouml;me sind in der Regel von Ca (V) 3 vermittelt, anstatt Ca (V) 2 Kan&auml;le Mai &Uuml;berpr&uuml;fung erfordern.

Ca (V) 2 Kan&auml;le vermitteln niedriger und hoher Spannung aktiviert Kalzium Str&ouml;me in Drosophila Motoneurons.

Methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) is a multi-functional regulator of gene expression. In humans loss of MECP2 function causes classic Rett syndrome, but gain of MECP2 function also causes mental retardation. Although mouse models provide valuable insight into Mecp2 gain and loss of function, the identification of MECP2 genetic targets and interactors remains time intensive and complicated. This study takes a step toward utilizing Drosophila as a model to identify genetic targets and cellular consequences of MECP2 gain-of function mutations in neurons, the principle cell type affected in patients with Rett-related mental retardation. We show that heterologous expression of human MECP2 in Drosophila motoneurons causes distinct defects in dendritic structure and motor behavior, as reported with MECP2 gain of function in humans and mice. Multiple lines of evidence suggest that these defects arise from specific MECP2 function. First, neurons with MECP2-induced dendrite loss show normal membrane currents. Second, dendritic phenotypes require an intact methyl-CpG-binding domain. Third, dendritic defects are amended by reducing the dose of the chromatin remodeling protein, osa, indicating that MECP2 may act via chromatin remodeling in Drosophila. MECP2-induced motoneuron dendritic defects cause specific motor behavior defects that are easy to score in genetic screening. In sum, our data show that some aspects of MECP2 function can be studied in the Drosophila model, thus expanding the repertoire of genetic reagents that can be used to unravel specific neural functions of MECP2. However, additional genes and signaling pathways identified through such approaches in Drosophila will require careful validation in the mouse model.

Drosophila as a model for MECP2 gain of function in neurons.

Methyl--CpG-verbindliches Protein 2 (MECP2) ist ein multifunktionales Regulator der Genexpression. Menschen Verlust von MECP2 Funktion bewirkt, dass klassische Rett-Syndrom, aber Gewinn von MECP2-Funktion bewirkt, dass auch geistige Retardierung. Obwohl Mausmodelle wertvolle Einblicke in die Mecp2-Gewinn und Verlust der Funktion bieten, bleibt die Identifizierung von MECP2 genetische Ziele und Interaktoren Zeit intensive und kompliziert. Diese Studie bedeutet einen Schritt zur Nutzung von Drosophila als Modell zur genetischen Ziele zu identifizieren und zellul&auml;re Folgen des MECP2 Gewinn der Funktion Mutationen in Neuronen, die Prinzip-Zelle geben in Patienten mit Rett-bezogene geistige Retardierung. Wir zeigen, dass heterologe Expression von menschlichen MECP2 in Drosophila Motoneurons deutliche M&auml;ngel in dendritische Struktur und das Verhalten der motor verursacht, wie mit MECP2-Gewinn der Funktion bei Menschen und M&auml;usen berichtet. Mehrere Zeilen Beweise legen nahe, dass bestimmte MECP2-Funktion dieser M&auml;ngel entstehen. Zuerst zeigen die Neuronen mit Verlust von MECP2-induzierte Dendrit normalen Membran Str&ouml;mungen. Zweite, Dendritische Ph&auml;notypen erfordern eine intakte methyl--CpG-Bindung-Dom&auml;ne. Dritte, Dendritische Defekte werden durch die Verringerung der Dosis von dem Umbau Protein, osa, darauf hinweist, dass MECP2 t&auml;tig werden kann, &uuml;ber Chromatin Umbau in Drosophila Chromatin ge&auml;ndert. MECP2-induzierte Motoneuron dendritische defekte Ursache spezifische motorische Verhalten M&auml;ngel, die einfach Tore in genetisches Screening. Zusammenfassend l&auml;sst sich sagen zeigen unsere Daten, dass einige Aspekte des MECP2-Funktion k&ouml;nnen, in der Taufliege-Modell untersucht werden, so erweitern das Repertoire der genetischen Reagenzien, die verwendet werden k&ouml;nnen, um spezifische neuronale Funktionen von MECP2 zu entwirren. Jedoch erfordert zus&auml;tzliche Gene und Signalwege durch solche Ans&auml;tze in Drosophila identifiziert vorsichtigen Pr&uuml;fung im Mausmodell.

Taufliege als Modell f&uuml;r MECP2 gewinnen Funktion in Neuronen.

Neuronen zeigen diverse feuern Muster. Sogar Neuronen geh&ouml;ren einer chemischen oder morphologischen Klasse oder der gleichen identifizierten Neuron, kann verschiedene Arten von elektrische Aktivit&auml;t anzeigen. Beispielsweise k&ouml;nnen Motoneuron MN5, die einen Flug Muskel von Erwachsenen Drosophila innerviert, unterschiedliche feuern Muster unter den gleichen Aufnahmebedingungen zeigen. Wir entwickelten ein zweidimensionales biophysikalische Modell und zeigen, dass ein Kern-Komplement von blo&szlig; zwei Kan&auml;len, Spannung-Gating ausreichend generieren feuern Muster Vielfalt. Wir schlagen Shab und DmNa (V), um zwei Kandidatengene zu sein, die diese Kern-Str&ouml;me zu codieren, und feststellen, dass &Auml;nderungen im Shab-Kanal Ausdruck im Modell Aktivit&auml;t, die &auml;hnlich wie die wichtigsten feuern Muster beobachtet bei MN5 Aufnahmen reproduziert werden k&ouml;nnen. Bifurkation-Analyse verwenden wir beschreiben die verschiedenen &Uuml;berg&auml;nge zwischen Rest und Staaten, die aus Variationen im Shab-Kanal Ausdruck ergeben spiking Verf&uuml;gbarmachen einer Verbindungs zwischen Ionen-Kanal Ausdruck, Bifurkation Struktur und feuern Muster in Modellen der potenziellen Membrandynamik.

Im Zusammenhang mit Ionen-Kanal Ausdruck, Bifurkation Struktur und diverse feuern Muster in einem Modell eine identifizierte Motoneuron.

Neurons show diverse firing patterns. Even neurons belonging to a single chemical or morphological class, or the same identified neuron, can display different types of electrical activity. For example, motor neuron MN5, which innervates a flight muscle of adult Drosophila, can show distinct firing patterns under the same recording conditions. We developed a two-dimensional biophysical model and show that a core complement of just two voltage-gated channels is sufficient to generate firing pattern diversity. We propose Shab and DmNa ( v ) to be two candidate genes that could encode these core currents, and find that changes in Shab channel expression in the model can reproduce activity resembling the main firing patterns observed in MN5 recordings. We use bifurcation analysis to describe the different transitions between rest and spiking states that result from variations in Shab channel expression, exposing a connection between ion channel expression, bifurcation structure, and firing patterns in models of membrane potential dynamics.

Article	Year
Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. Journal of neurophysiology\| PubMed ID: 19828724	2009
Expanding the neuron's calcium signaling repertoire: intracellular calcium release via voltage-induced PLC and IP3R activation. PLoS biology\| PubMed ID: 17341135	2007
Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. Journal of neurophysiology\| PubMed ID: 18715893	2008
Ca(v)2 channels mediate low and high voltage-activated calcium currents in Drosophila motoneurons. The Journal of physiology\| PubMed ID: 22183725	2012
Drosophila as a model for MECP2 gain of function in neurons. PloS one\| PubMed ID: 22363746	2012
Relating ion channel expression, bifurcation structure, and diverse firing patterns in a model of an identified motor neuron. Journal of computational neuroscience\| PubMed ID: 22878689	2012

Stefanie Ryglewski

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