方法文章

利用 HepG2 细胞系展示用于组织工程的静电纺丝聚合物形貌调控

DOI：

10.3791/61043

⸱

2020年5月25日

 ,  , 
1Institute for Bioengineering, School of Engineering, University of Edinburgh, 2Scottish Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方法可用于测试不同形态和表面形貌的聚己内酯纤维在组织工程中的应用。通过静电纺丝技术制备出具有随机取向、定向排列以及多孔冷冻结构的小直径和大直径纤维，并将其作为细胞培养的平台。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

静电纺丝技术使研究人员能够可重复地制备微米至纳米级的聚合物纤维。静电纺丝聚合物的三维纤维结构被视为对细胞外基质（ECM）的结构模拟。因此，由生物相容性聚合物制备的静电纺丝纤维已被组织工程领域的研究人员广泛研究，探索其作为人工细胞外基质在体外和体内引导组织生长的潜力。所有细胞均对其力学环境高度敏感。这一点已通过发现多种与细胞骨架肌动蛋白丝内在关联的机械转导通路得到证实。细胞骨架作为力学传感器，可根据底物的刚度和形貌调控宿主细胞的功能与分化。静电纺丝纤维可通过调控纤维尺寸和形貌，便捷地调节纤维聚合物支架内的力学环境。本文描述了在两种不同纤维直径（1 µm 和 5 µm）下，制备三种不同形貌的聚己内酯（PCL）纤维的静电纺丝方法。纤维形貌类别包括随机取向纤维、取向排列纤维以及多孔冷冻纺丝纤维。本研究所详述的方法旨在为研究静电纺丝纤维结构对组织生成的影响提供一个平台。深入理解这些影响将有助于研究人员优化静电纺丝纤维的力学性能，并更充分地展示该技术的潜力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近几十年来，组织工程方法不断发展，旨在为细胞提供一种仿生环境，以促进体外组织模型构建和体内再生技术的成功组织再生。这些方法通常通过细胞自身聚集或借助引导性支架来促使细胞形成三维聚集体1。支架可被制备为多孔或纤维状的聚合物纳米/微米结构，也可制成高吸水性的水凝胶2,3,4。聚合物静电纺丝是一种常见的制备技术，可产生无纺纳米-微米级聚合物纤维基质，模拟天然细胞外基质（ECM）的纤维结构5。多种生物相容性聚合物均可用于静电纺丝过程，因此静电纺丝纤维成为促进组织再生的常用介质6,7,8。静电纺丝纤维已被应用于多种组织的培养，展现出一种低成本且可重复的支架平台前景9,10,11,12,13。

细胞对其力学环境具有高度敏感性。先前的研究强调了这种被称为机械转导（mechanotransduction）的重要关系，其可影响细胞功能、形态以及分化过程14,15。真核细胞细胞骨架的基础由丝状肌动蛋白构成，在细胞分裂、黏附、迁移、收缩和形态维持中发挥关键的力学作用。细胞骨架可通过与细胞外表面蛋白的连接，响应外部力学刺激而被调控16,17,18。已有大量研究表明，通过改变可附着基底的形状，可影响干细胞的形态，从而控制细胞形态并引导其分化过程19,20。此外，细胞所附着基底的刚度也会影响干细胞的命运和谱系选择21,22。除干细胞外，这些效应也被发现会影响不同谱系的细胞23,24。三维组织工程技术已显示出与二维机械转导研究类似的结果，无论是在水凝胶还是纤维支架中均如此25,26,27。此外，基底的力学信号还可通过细胞间信号传导在三维细胞聚集体中传递28。材料的力学性能在调控细胞功能方面起着至关重要的作用，因此应成为工程化组织支架设计中的主要考虑因素。

本方法的目的是研究静电纺丝聚己内酯（PCL）纤维的尺寸和形貌对体外细胞培养的影响。该方法改编自以往专注于肾脏组织工程的研究9。本文提供了更为详尽的分步操作流程，以促进支架的重建，并建立一种适用于所有细胞类型的标准化方法。通过该方法构建了六组支架：其中三组为大直径5 µm纤维（LG），另外三组为小直径1 µm纤维（SM），采用不同浓度的PCL制备。在LG和SM组内，又分为三种不同的形貌结构：随机排列纤维（RA）、取向排列纤维（AL）和多孔低温纤维（CR）。这些支架组具有本质不同的结构，从而为细胞附着提供独特的局部力学环境。为了展示这种形貌对细胞的影响，以HepG2细胞系作为代表性研究，将其接种于各组支架上。本方法可作为从干细胞、细胞系到原代细胞等各种细胞类型静电纺丝支架设计的基础分析方法。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 溶液配制

  1. 大尺寸（随机、取向及低温）纤维
    1. 使用玻璃刻度移液管在耐溶剂玻璃瓶中混合 50 mL 氯仿和 10 mL 甲醇，配制 5:1 的氯仿与甲醇混合液。
      警告：氯仿和甲醇为有毒溶剂，配制过程必须在通风橱中进行。
    2. 为制备 19 w/v% 的 PCL 在 5:1 氯仿:甲醇溶液中的溶液，称取 1.9 g PCL，加入 10 mL 5:1 氯仿:甲醇混合液的耐溶剂玻璃小瓶中。用保鲜膜双层密封小瓶，并置于滚轴混合器上过夜，使 PCL 完全溶解。
      警告：配制过程必须在通风橱中进行。
  2. 小尺寸（随机及取向）纤维
    1. 为制备 7 w/v% 的 PCL 在六氟异丙醇（HFIP）中的溶液，称取 0.7 g PCL，加入 10 mL HFIP 于耐溶剂玻璃小瓶中混合。用保鲜膜双层密封小瓶，并置于滚轴混合器上过夜，使 PCL 完全溶解。
      警告：HFIP 具有高毒性，配制过程必须在通风橱中进行。
  3. 小尺寸低温纤维
    警告：配制过程必须在通风橱中进行。
    1. 使用玻璃刻度移液管在耐溶剂玻璃瓶中混合 30 mL 氯仿和 10 mL 甲醇，配制 3:1 的氯仿与甲醇混合液。
    2. 为制备 14 w/v% 的 PCL 在 3:1 氯仿:甲醇溶液中的溶液，称取 1.4 g PCL，加入 10 mL 3:1 氯仿:甲醇混合液的耐溶剂玻璃小瓶中。用保鲜膜双层密封小瓶，并置于滚轴混合器上过夜，使 PCL 完全溶解。

2. 电纺丝装置

注意：必须在开始静电纺丝过程之前设置参数。

  1. 针头尺寸与放置
    1. 对于大尺寸纤维（随机、取向及冷冻电纺），使用外径1 mm、内径0.8 mm的黄铜针头，并将针头置于距收丝辊表面230 mm处。
    2. 对于小尺寸纤维，使用外径1 mm、内径0.4 mm的黄铜针头，并将针头置于距收丝辊表面15 mm处。
  2. 针头横向运动
    注：图 1 中所述支架在制备过程中采用100 mm针头行程、50 mm/s速度，并在整个过程中持续进行左右往复运动。
    1. 设置横向运动时，按下 运动 | TNS 1，将 起始位置 [mm] 设为 -50，行程距离 [mm] 设为 100，速度 [mm/s] 设为 50，转向延迟 [ms] 设为 750。
  3. 注射泵流速
    1. 对于大尺寸纤维（随机、取向及冷冻电纺），在用户界面上点击 材料 选项卡，并将注射泵设为4 mL/h。
    2. 对于小尺寸（随机和取向）纤维，将注射泵设为0.8 mL/h。
    3. 对于小尺寸冷冻电纺纤维，将注射泵设为2.5 mL/h。
  4. 电压设置
    1. 对于大尺寸纤维，点击用户界面上的 电压 选项卡，将针头电压设为+15 kV，收丝辊电压设为-4 kV。
    2. 对于小尺寸（随机和取向）纤维，将针头电压设为+17 kV，收丝辊电压设为-4 kV。
    3. 对于小尺寸冷冻电纺纤维，将针头电压设为+18 kV，收丝辊电压设为-4 kV。
  5. 收丝辊转速（大尺寸与小尺寸纤维）
    1. 对于随机纤维，按下 运动 | 目标，将收丝辊转速设为250 rpm。
    2. 对于取向纤维，将收丝辊转速设为1,800 rpm。
    3. 对于冷冻电纺纤维，将收丝辊转速设为180 rpm。

3. 随机与取向纤维（粗纤维与细纤维）的静电纺丝

  1. 将针头（有关针头尺寸和放置的信息参见第2.1节）插入1 mm内径的PTFE管中，并固定在静电纺丝针头夹持器内。
  2. 在通风橱中，将10 mL聚合物溶液转移至聚丙烯或玻璃（耐溶剂）注射器中。确保在启动前让注射器静置，以去除任何气泡。
  3. 通过PTFE管将注射器连接至针头，并将注射器固定在注射泵中。连接后，通过轻压注射器推杆并用聚合物溶液填充管道来预充PTFE管。
  4. 用铝箔包裹收丝辊，并将其固定在收丝辊旋转装置上。
  5. 按下运动 | 目标 | 旋转启动收丝辊旋转，按下材料 | 启动泵1启动注射泵。
  6. 当针头末端形成一小滴聚合物时，按下激活高压按钮开启电压。随后应从聚合物溶液形成的圆锥形突起（称为泰勒锥）中喷射出聚合物射流。检查收丝辊表面，确认纤维已沉积其上。
  7. 持续进行静电纺丝，直至所需量的PCL溶液完成纺丝。
    注：对于图1中所示支架，共纺丝4 mL溶液。
  8. 静电纺丝结束后，从收丝辊上取下覆盖有纤维的铝箔，并置于通风橱中过夜，以使多余溶剂充分挥发。
  9. 溶剂挥发后，将纤维在室温（RT）下储存。

4. 冷冻电纺纤维的制备

  1. 进行低温静电纺丝时，使用低温纺丝芯轴。重复步骤 3.1–3.3，然后执行以下步骤。
  2. 用铝箔包裹芯轴。
  3. 向芯轴内填充干冰颗粒。将低温纺丝芯轴盖固定在芯轴上，确保干冰不会逸出，但压力可以释放。芯轴表面应几乎立即形成冰晶。
    警告：操作干冰时需佩戴防护手套，以防冻伤。
  4. 将芯轴固定在芯轴旋转装置上，并立即通过按下 运动 | 目标 | 旋转 启动芯轴旋转，同时通过按下 材料 | 启动泵 1 启动注射泵。
  5. 当针头末端形成聚合物液滴后，按下 激活高压 以接通电压。随后应从聚合物溶液的锥形突起（即泰勒锥）处喷射出聚合物射流。检查芯轴表面，确认纤维已沉积在芯轴上。
  6. 静电纺丝进行 1 小时后，按下 全部停止 暂停过程，并为芯轴补充干冰。补充干冰时应确保充分防护，避免接触溶剂蒸气。在整个 4 小时的静电纺丝过程中，共执行此操作 3 次。
    注意：可通过重复步骤 4.4 和 4.5 恢复静电纺丝。
  7. 静电纺丝结束后，小心取下芯轴，并立即放入冷冻干燥机中干燥 24 小时，以使芯轴表面的冰晶升华。
  8. 升华完成后，从芯轴上取下覆盖有纤维的铝箔，并在室温下保存，注意避免压碎。

5. 支架打孔

  1. 使用10−12 mm的活检打孔器从纤维片上打孔获取支架。如果纤维仍粘附在铝箔上，将支架置于70%乙醇中以促进其脱离。

6. 灭菌与等离子体涂层

  1. 将支架（每孔1个支架）放入24孔或48孔板中，用70%乙醇洗涤3次。最后一次洗涤后保持支架浸没在乙醇中，将板置于-80 °C冰箱中，使其完全冻结。
  2. 待支架完全冻结后，将板放入冷冻干燥机中，冻干24小时。干燥后的支架即可进行等离子体表面处理。
    注意：若无等离子体处理设备，可将支架浸入含1%抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于37 °C孵育过夜。
  3. 将板放入等离子体处理腔室，打开盖子。在500 mTorr压力和中等射频（RF）功率条件下运行等离子体处理仪30秒。
  4. 等离子体处理完成后，将支架浸入1 mL PBS溶液（含1% Anti-Anti）中。支架应能迅速吸收PBS溶液。
    注意：此时支架已准备好用于细胞接种。

7. 细胞的制备与接种

注意：以下提供的基本细胞培养技术是针对代表性结果中用于演示的 HepG2 细胞。这些原则可适用于任何贴壁细胞类型；但不同细胞可能需要不同的材料和不同的操作流程。细胞操作必须在生物安全柜中进行，并遵循无菌操作技术。

  1. 取1 × 106个冻存的HepG2细胞，接种于含12 mL完全培养基的T75细胞培养瓶中，完全培养基由添加了10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素、5 mM L-谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的Eagle最小必需培养基（EMEM）组成。
  2. 当细胞达到80%融合度时，用PBS洗涤3次，加入2 mL胰蛋白酶，在37 °C孵育4分钟，使细胞从培养瓶表面脱离。轻敲培养瓶后，细胞应脱落。
  3. 加入8 mL完全培养基以终止胰蛋白酶消化作用。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在离心机中以120 × g离心5分钟，沉淀细胞。
  4. 用移液器吸除细胞沉淀上方的上清液，加入5 mL完全培养基。使用5 mL血清移液管反复吹打，重悬细胞。
  5. 采用台盼蓝排斥法计数所得细胞悬液。取100 µL细胞悬液加入含有100 µL台盼蓝的1.5 mL离心管中。将混合液滴加至血细胞计数板上，并盖上盖玻片，在显微镜下计数细胞。
  6. 通过添加或去除完全培养基，将细胞浓度调整至2.6 × 106个/mL。若需去除培养基，以220 × g离心5分钟，吸除所需体积的培养基后重悬细胞。
  7. 用移液器吸除孔板中PBS配制的1% Anti-Anti溶液，使用200 µL移液器将50 µL浓度为2.6 × 106个/mL的细胞悬液接种至支架表面。
  8. 将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育1–3小时，使其贴壁，注意避免干燥。细胞贴壁后，加入300 µL（48孔板）或500 µL（24孔板）培养基，继续在37 °C、5% CO2条件下培养。
    注意：此后可采用标准细胞培养技术，直至进行进一步功能分析。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图1展示了由PCL溶液制备的细纤维（约1 µm）和粗纤维（约5 µm）的扫描电子显微镜（SEM）图像。在进行SEM成像前，样品经溅射镀膜仪使用金-钯（60:40）合金溅射镀膜30秒。粗纤维是通过在氯仿与甲醇（5:1）溶液中使用高浓度（19 w/v%）的PCL制备高黏度PCL溶液，并在高流速下进行静电纺丝，使聚合物溶液在电场中形成较粗的射流。因此，需要较大的针头与收丝辊之间的距离（230 mm），以确保溶剂在沉积到收丝辊前充分蒸发。相反，细纤维是通过在六氟异丙醇（HFIP）中使用低浓度（7 w/v%）PCL制备低黏度PCL溶液，并在低流速下进行静电纺丝，使针头在电场中释放出更细的溶液射流。更细的射流促进了溶剂的快速蒸发，因此针头需更靠近收丝辊（70 mm），以确保纤维稳定沉积。在制备小直径低温纤维时，需调整PCL溶液以建立可靠的实验方案。使用HFIP中的PCL在低温收丝辊上反复静电纺丝会导致纤维结构崩解。将PCL浓度调整为14 w/v%，并使用氯仿与甲醇（3:1）混合溶剂进行静电纺丝可解决此问题；但该条件会导致支架中纤维尺寸的变异性增大。各支架中纤维的取向程度（纤维半径与取向）通过ImageJ的DiameterJ插件29进行分析，结果如图2和图3所示。

电纺纤维形貌，扫描电镜图，显示小/大尺寸随机、取向及低温冷冻样品的对比。
图1：扫描电镜图像显示各支架组的形貌特征。 上排显示小直径纤维，下排显示大直径纤维。形貌分组从左至右依次为随机纤维、取向纤维和低温冷冻纤维。请点击此处查看该图的放大版本。

纤维分析；半径与取向图；随机、取向、低温样品；数据比较。
图 2：来自 DiameterJ 插件对少量纤维的纤维半径（左）和纤维取向（右）数据。 形态学从上至下依次为随机纤维、取向纤维和低温纤维。 请点击此处查看此图的放大版本。

纤维分析；半径与取向图；随机、取向、低温；数据比较。
图3：通过DiameterJ插件分析大量纤维所得的纤维半径（左）和纤维取向（右）数据。 纤维形貌自上而下依次为随机纤维、取向纤维和低温纤维。请点击此处查看该图的放大版本。

该方法为我们提供了一组具有六种明显不同拉伸性能的支架，这些性能是根据先前描述的方法9使用拉伸试验机测定的。表1显示，大尺度取向纤维的宏观杨氏模量为46.94 ± 3.48 MPa，而大尺度低温纤维的杨氏模量为0.20 ± 0.01 MPa。生理组织的刚度值范围从100 Pa（神经组织）到2−4 GPa（骨组织）30；本文报道的所有支架刚度值均在此范围内。

支架应变%下的杨氏模量（MPa）
0–2%2–4%4–6%6–8%8–10%
SM.RA11.14 ± 2.139.31 ± 0.436.75 ± 0.644.75 ± 0.593.32 ± 0.40
SM.AL27.94 ± 8.6328.27 ± 7.3616.34 ± 4.879.10 ± 3.755.85 ± 3.11
SM.CR0.27 ± 0.110.31 ± 0.440.31 ± 0.650.29 ± 0.590.26 ± 0.40
LG.RA9.23 ± 0.788.22 ± 0.875.96 ± 0.683.96 ± 0.592.63 ± 0.45
LG.AL46.94 ± 3.4838.03 ± 2.4627.69 ± 1.2216.10 ± 1.617.87 ± 1.32
LG.CR0.20 ± 0.010.16 ± 0.010.12 ± 0.010.10 ± 0.010.09 ± 0.01

表1：各支架组在2%应变间隔下的拉伸测试数据。 SM.RA = 小尺寸随机，SM.AL = 小尺寸取向，SM.CR = 小尺寸冷冻，LG.RA = 大尺寸随机，LG.AL = 大尺寸取向，LG.CR = 大尺寸冷冻。数据以均值 ± 标准差表示，n = 5。

图4展示了使用DAPI和鬼笔环肽染色以观察细胞形态的方法。该染色方法在文献中已有 established11,12。图像使用显微镜（材料表）配合40倍物镜获取。图像显示，本方法制备的取向纤维可拉长hepG2细胞的形态，并引导增殖细胞沿纤维长度方向排列，从而在细胞培养中形成方向性。相比之下，随机纤维上的hepG2细胞未表现出在取向结构中观察到的方向性增殖和伸长现象。在随机结构上，hepG2细胞呈现较为规则的形态，并伸出突起与周围的PCL纤维相连。

显示DAPI和鬼笔环肽染色的显微镜荧光图像；细胞排列比较。
图 4：在不同支架形貌上染色的 HepG2 细胞，DAPI（蓝色）和鬼笔环肽（绿色）：随机排列（左）、定向排列（中）和低温制备（右）。 上排显示小纤维，下排显示大纤维。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过结合不同的溶剂、PCL浓度和静电纺丝参数，可制备出不同尺寸的纤维。聚合物的种类、其分子量以及溶剂对所得溶液的黏度和电荷特性具有显著影响，因而强烈影响静电纺丝性能31。本方法中所列电压可能因静电纺丝实验条件的不同而需要调整。温度和湿度会影响静电纺丝过程的行为32。因此，建议操作者根据实际情况调整电压，以克服可能的干扰并形成稳定的泰勒锥。建议将静电纺丝装置置于环境控制舱内，以减少静电纺丝过程中批次间的差异性。

实现本方法中所展示的不同形貌，得益于IME静电纺丝装置的性能。可变转速的收丝装置（mandrel）对于控制纤维取向至关重要。当收丝装置以较低转速（<250 rpm）旋转时，由于聚合物射流的行为，会得到随机取向的纤维。当带电聚合物溶液从针头喷出时，其内部电荷与空气动力学力共同引发一种混乱的鞭动效应，该效应被用于在收丝装置上沉积无规排列的纤维33,34。通过将收丝装置转速提高至1,800 rpm以上，可克服这种鞭动效应。在如此高转速的收丝装置上沉积的纤维呈现出高度取向的结构，因为其表面速度足以有效抵消纤维鞭动过程中产生的横向运动。需要注意的是，当使用高转速收丝装置时，可能会扰动周围气流，从而对稳定泰勒锥的形成产生不利影响。

通过在-78.5 °C下用干冰填充芯轴，可制备高度多孔的低温支架。该方法可降低芯轴温度，促进水滴在其表面凝结并冻结。所形成的冰晶从芯轴表面突出，纤维则沉积于这些冰晶结构上。当冰晶升华后，纤维的多孔结构仍保留在芯轴上35,36。由于冰晶具有重量且质地脆弱，限制了制备取向多孔纤维的能力；当芯轴转速过高（>250 rpm）时，过大的向心力和空气动力会导致冰晶和纤维从芯轴上脱落。由于所形成的结构较为脆弱，该方法在操作过程中可能遇到困难。在处理芯轴以及后续处理支架时必须格外小心，因为这些结构在受压时容易被压平，在从液体中取出时易发生折叠。此外，原本能够成功进行电纺但未使用低温芯轴的溶液，可能会因温度变化和冰晶结构的形成而完全无法纺丝。在低温纺丝过程中，芯轴表面形成的冰量高度依赖环境湿度，从而导致最终结果的不一致性。因此，强烈建议将电纺过程置于环境控制密闭腔室内进行。

为了评估细胞在这些支架上的性能，有必要在使用前对材料进行灭菌。目前有多种可用于聚合物灭菌的方法，包括化学法、辐射法和基于热的方法37,38。重要的是要评估每种方法的有效性，以及其对材料用途和材料本身适用性的影响。本方案采用70%乙醇灭菌，随后进行冻干、等离子体处理，并浸入1% Anti-Anti溶液中。使用乙醇可使蛋白质和微生物变性并脱水，同时不会破坏PCL材料37。使用更强的溶剂可能导致PCL溶解。本方法中引入等离子体处理，主要是为了提高PCL的亲水性（PCL本身具有显著的疏水性），从而改善细胞黏附39,40。此外，该步骤还可作为二次灭菌手段，但必须注意在等离子体处理前后将支架保持在无菌环境中。该方法已被证明适用于使用抗生素处理培养基的体外研究。然而，对于体内应用，则必须考虑更可靠的灭菌方式，如环氧乙烷（EtO）和γ射线辐照。完成灭菌后，可将细胞接种至支架上，并采用标准的细胞培养技术在体外构建三维细胞培养体系。

需要注意的是，刚度值应归因于支架内形成的不同微结构。支架之间的本体材料（PCL）保持不变，因此各组之间的本体材料刚度不会发生变化。冷冻支架由于纤维网络内部连接性降低，表现出明显低于其他组的刚度，如表1所示。连接性的降低被认为会引发以弯曲为主的变形，而非纤维结构中的以拉伸为主的变形41。有趣的是，在随机分布和冷冻组中，支架刚度对纤维尺寸的依赖性并不显著。然而，取向纤维的纵向刚度对纤维尺寸表现出明显更高的依赖性，在0-2%应变下的杨氏模量小纤维为27.94 ± 8.63 MPa，大纤维为46.94 ± 3.48 MPa。由于拉伸试验本质上是拉伸变形，这意味着在纵向截面中具有更高的本体PCL密度。有必要再次强调，此处提供的力学数据是对纤维结构的宏观力学快照。进一步的微观力学表征将有助于全面理解在细胞尺度上的力学影响。

本方法中包含了随机和定向排列的结构，以提供各向同性与各向异性形貌之间的比较。纤维定向排列的程度可通过图2中的扫描电镜图像以及图2和图3中提供的纤维分析结果进行观察。人体许多组织均表现出各向异性特性，尤其常见于肌肉和神经组织中所存在的定向排列的细胞结构。定向排列的聚合物纤维结构能够在体外模拟这些有序结构42,43。如前所述，细胞功能对形态学和力学变化具有敏感性，因此应对支架上结合的细胞进行进一步的功能分析，以确定每种支架类型的生物学影响。

与其他现有的支架制备技术相比，该方法提供了一种简便的方式，可相对精确地控制微米级支架结构的力学性能和形貌。其他聚己内酯（PCL）支架制备方法，如相分离、盐沥滤和气体发泡法，能够在孔隙空间和孔径方面实现一定的形貌控制。然而，其孔隙结构和几何形态在很大程度上保持不变44,45,46,47。因此，与静电纺丝相比，诸如各向同性程度等特性难以灵活调节。水凝胶材料因适用于支架制备而广受欢迎，可通过调节交联聚合物链的程度来改变聚合物基质的刚度48。此外，还可通过多种方法实现3D打印，从而对支架形貌实现优异的控制49。然而，在生物相容性水凝胶材料中实现静电纺丝级别的分辨率，仍面临实际应用上的挑战50,51。在过去十年中，静电纺丝支架在组织工程研究中被广泛使用，研究人员持续探索引入新材料、新应用以及不同细胞类型的可能性。尽管不断有新型材料被开发用于静电纺丝支架，但对现有静电纺丝材料和方法进行更深入生物学表征的机会仍然存在。本文所述方法旨在促进体外生物学研究，因其可直接应用于基础细胞培养技术。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了工程与物理科学研究理事会基金（资助编号：EP/N509644/1）、UKRMPII 基金（资助编号：MR/L022974/1）以及 MRC CCBN 基金（资助编号：MR/L012766/1）的支持。作者谨此感谢 Dr. Alison McDonald 和 Dr. David Kelly（COIL）在显微成像方面的协助与支持，同时感谢 Prof. Alistair Elfick 提供实验室设施的使用权限（生物工程研究所）。 

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mm 活检打孔器AcudermP1025
15 mL Falcon 离心管Thermo-scientific339650
20 mL 玻璃小瓶Fisherbrand11513542
48 孔细胞培养板Greiner Bio-one677180
Anti-Anti 100XGibco15240062
氯仿Acros Organics13029236
DAPISigma-aldrichD9542
伊格尔必需培养基Gibco11090081
静电纺丝仪IME TechnologiesEC-DIG
胎牛血清GE HealthcareSH30071.03
金-钯溅射镀膜仪EmscopeSC500A
HepG2 细胞系Sigma-aldrich85011430
六氟异丙醇 (HFIP)Manchester OrganicsG26383
L-谷氨酰胺 200 mMGibco25030081
MEM 非必需氨基酸Gibco11140050
甲醇Acros Organics11984591
青霉素-链霉素 10,000 U/mLGibco15140122
鬼笔环肽Abcamab176754
磷酸盐缓冲液 (PBS)Sigma-aldrichP4417-100TAB
等离子体镀膜仪Harrick PlasmaPDC-002
聚己内酯 (平均分子量 80,000)Sigma-aldrich440744
PTFE 注射器Fisherbrand12941031
扫描电子显微镜HitachiS4700
T75 培养瓶CorningCLS430641
台盼蓝 (0.4%)Gibco15250061

参考文献

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