组织特异性RNAi工具用于鉴定系统性应激信号通路组分

摘要

生物体蛋白质稳态的维持需要不同组织之间伴侣分子表达等蛋白质质量控制反应的协调。本文提供了在 C. elegans 中使用的工具，可用于监测特定组织中的蛋白质稳态能力，并确定细胞间信号传导反应。

摘要

在过去十年中，人们对蛋白质质量控制过程调控机制的认识取得了突破性进展，揭示了细胞间信号传导过程在调控非细胞自主性蛋白质稳态中的重要性。近期研究开始揭示从一种组织到另一种组织协调蛋白质质量控制的信号组分和通路。因此，明确非细胞自主性蛋白质稳态网络（PN）的机制与组分，及其在衰老、应激反应和蛋白质错误折叠疾病中的作用，具有重要意义。在实验室中，我们采用组织特异性RNAi介导的基因敲降，结合应激报告系统和组织特异性蛋白质稳态传感器来研究这一过程。本文描述了用于检测和鉴定非细胞自主性PN组分的方法，这些组分可在感知应激条件的组织以及响应细胞中发挥作用，从而激活保护性反应。我们首先介绍如何构建用于在特定组织中实现组成型基因敲降的发夹RNAi载体，以及如何在不同生命周期阶段通过饲喂RNAi实现组织特异性基因敲降。应激报告系统 和行为学检测作为 有效的检测指标 ，可实现对调控系统性应激信号通路的基因和条件进行快速筛选。 最后，利用在不同组织中表达的蛋白质稳态传感器，可检测发育和衰老不同阶段中PN组织特异性能力的变化。因此，这些工具将有助于阐明并监测特定组织中PN的功能能力，同时帮助鉴定在不同组织中发挥作用以介导生物体非细胞自主性PN的组分。

引言

细胞蛋白质稳态由一个复杂的蛋白质质量控制网络进行监控，该网络包括分子伴侣、应激反应以及降解机制，如泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬^1,2。应激反应通路的激活，例如由HSF-1介导的热休克反应（HSR）、内质网未折叠蛋白反应（UPR^ER）以及线粒体未折叠蛋白反应（UPR^mito），对于细胞在环境胁迫或导致毒性蛋白聚集的蛋白质错误折叠疾病中的适应与存活至关重要^1,2,3,4,5,6。

多细胞生物的细胞蛋白质稳态由一个额外的调控层面协调，例如 秀丽隐杆线虫, 需要协调不同组织中的细胞应激反应，以激活分子伴侣等保护性蛋白质质量控制组分⁷在过去十年中，已观察到热休克反应（HSR）和未折叠蛋白反应（UPR）等“细胞”应激反应通路存在细胞非自主性激活现象。^内质网 和未折叠蛋白反应（UPR）^线粒体以及跨细胞伴侣信号传导（TCS）^3,4,7,8,9,10在每种情况下，神经系统以及肠道发出的信号都在调控不同组织中分子伴侣的激活方面发挥着关键作用，以抵御急性和慢性蛋白质错误折叠应激所带来的毒性后果^3,5,9,11。这种从神经元向肠道及外周其他细胞的信号传递可通过神经递质实现，未折叠蛋白反应（UPR）即属于此种情况^内质网 和HSR^6,8,11在一种由神经元中HSP-90表达升高所激活的细胞非自主性应激信号通路TCS中，分泌型免疫肽在激活过程中发挥作用 hsp-90 从神经元到肌肉的分子伴侣表达⁵在另一种TCS形式中，降低主要分子伴侣的表达水平 hsp-90 在肠道中导致热诱导型表达增加 hsp-70 在允许温度下位于体壁肌肉中^5,10然而，在这一特定情况下，介导肠道感知应激信号并激活肌肉细胞响应的具体信号分子尚不清楚。

因此，为了确定分子伴侣表达如何在不同组织间被激活，需要一种能够监测蛋白质稳态网络（PN）功能及应激反应在组织特异性水平上激活情况的方法。为研究在各个组织中被激活的应激反应通路，可利用一系列已有的与荧光蛋白标签融合的转录型分子伴侣报告系统（参见 表3）。这些包括荧光标记的 hsp-90, hsp-70 和 hsp-16.2 指示热激反应（HSR）诱导的转录报告基因， hsp-4 表明未折叠蛋白反应（UPR）的激活^内质网 和 hsp-6，表明未折叠蛋白反应（UPR）^线粒体将这些报告系统与组织特异性应激条件相结合，可实现强有力的检测输出，精确定位那些对感知应激的远端“信号发出”组织中蛋白质稳态（PN）失衡产生响应的特定组织。为在特定组织中诱导应激状态或蛋白质稳态（PN）失衡，可采用多种不同策略。例如，其中一种方法是异位表达激活形式的应激转录因子（如 xbp-1s）另一种方法是降低一种必需的分子伴侣的表达水平（例如， hsp-90) 使用组织特异性启动子^8,10为了仅在一种细胞类型中耗竭 PN 组分，利用 RNAi 进行组织特异性敲低是一种有效的工具。

C. elegans 中的 RNAi 具有系统性；环境中的双链 RNA 可进入生物体并在整个动物体内扩散，从而沉默靶基因^12,13。这种摄入的 dsRNA 的系统性扩散由 SID（系统性 RNAi 缺陷）蛋白介导，例如作为 dsRNA 转运蛋白的 SID-1 和 SID-2，以及与晚期内体蛋白共定位并参与摄入的 dsRNA 外排的 SID-5^14,15,16。SID-1 是一种多通道跨膜蛋白，存在于除神经元以外的所有细胞中 ，并且对 dsRNA 向细胞内的导入和导出均是必需的¹⁷。SID-2 的表达局限于肠道，在那里它作为内吞受体，将来自肠腔的摄入 dsRNA 转运至肠细胞的细胞质中¹⁶。神经元对系统性 RNAi 无反应，这与神经元中跨膜蛋白 SID-1 表达水平降低相关，而 SID-1 对 dsRNA 的导入至关重要^15,18。因此，若要使组织特异性 RNAi 仅在一种细胞类型中发挥作用，就必须阻止 dsRNA 的系统性扩散。这可以通过使用对 RNAi 具有抗性的 sid-1(pk3321) 突变体来实现，该突变体可阻止 dsRNA 在不同组织间的释放和摄取¹⁵。在此突变体中表达组织特异性的发夹 RNAi 构建体，或在特定组织中异位表达 SID-1，即可弥补 sid-1 突变体的功能缺陷，从而实现组织特异性的 RNAi¹⁹。

那么，在 sid-1 功能缺失突变体中，dsRNA 如何被肠道摄取，并如何到达异位表达 SID-1 构建体的神经元或肌肉细胞？目前有一种模型可解释该机制：内吞的 dsRNA 通过 SID-2 进入肠细胞胞质，随后通过一种不依赖 SID-1 的机制（涉及 SID-5 和转胞吞作用）被转运至假体腔¹⁷。因此，由于 SID-1 是 dsRNA 导入所必需的¹⁷，只有表达野生型 SID-1 的细胞才能摄取从肠道释放到假体腔中的 dsRNA。

本文演示了一组可用于组织特异性RNAi的工具的使用方法。我们以分子伴侣Hsp90为例，描述了发夹结构RNAi的构建过程，该方法可用于在特定组织中持续敲低基因表达¹⁰。所描述的方法可适用于任何目标基因。通过监测其他组织中荧光标记的应激报告基因的表达，可以探究其他组织对由组织特异性hsp-90 RNAi引起的蛋白质稳态失衡的响应。作为第二种组织特异性RNAi方法，我们展示了如何将sid-1突变体系统用于喂养表达RNAi的细菌，而非表达发夹RNAi构建体。当进行候选基因或全基因组范围的RNAi筛选以鉴定参与组织特异性响应的组分时，该方法尤为有用。同样，针对重要PN组分缺失所导致的发育缺陷，需要在发育后期阶段对特定组织进行RNAi介导的基因敲低。我们展示了如何利用SID-1互补系统对组织特异性TCS调控因子进行候选RNAi筛选。在该示例中，我们的目标是鉴定那些在“应激感知”信号发送组织（肠道）和应激效应组织（肌肉）中敲低后，会导致肌肉细胞中荧光标记的hsp-70报告基因表达发生变化的信号通路组分。

方案

1. 两种组织特异性RNAi方法：发夹RNAi与组织特异性SID-1互补

1. 组织特异性表达的发夹RNAi载体构建 sid-1 突变体
   1. 扩增目的基因序列（例如， hsp-90 序列分离自 hsp-90 来自Ahringer RNAi文库的RNAi克隆²⁰) 通过 PCR。将一个非回文序列置于 3’ 端 hsp-90 序列，即 SfiI 位点（ATCTA）²¹.
      注意：用于克隆的引物 hsp-90 带有 SfiI 序列（下划线标出）的为：
      as-hsp90-SfiI 5’-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3’
      as-Hsp90 5’ TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3’
   2. 将扩增的序列亚克隆至商业克隆试剂盒载体中 （例如，TOPO pCR BluntII）。
   3. 分离倒置的 hsp-90 序列来自 hsp-90 RNAi 克隆（Ahringer RNAi 文库）²⁰ 通过使用 XbaI 和 PstI 限制性酶切位点进行限制性消化，并将其置于下游 hsp-90-SfiI 载体中的序列（来自步骤 1.1.1），从而产生一个 hsp-90 发夹结构（图1).
   4. 将发夹结构亚克隆至 Gateway 入门载体 pDONR221 中并进行融合 含有组织特异性启动子的Gateway入门克隆，用于在神经元中表达（rgef-1p 在肠道中 (vha-6p) 或体壁肌 (unc-54p）以及 unc-54 3’非翻译区 （或根据供应商提供的方案，选择任意其他3'非翻译区）通过Gateway反应进行操作。
   5. 将获得的发夹RNAi构建体线性化（图1) 使用编码序列外的唯一限制性位点，将1 ng/µL的发夹RNAi构建体与100 ng/µL N2 Bristol基因组DNA（用ScaI消化）混合，作为复合阵列以显微注射方式注入 秀丽隐杆线虫 表达该基因的菌株 hsp-70p::RFP 报告基因（菌株 AM722）并导入到遗传背景中 sid-1(pk3321) 突变体（菌株NL3321）。有关如何进行复杂阵列显微注射的实验方案，请遵循²².
   6. 作为阴性对照，使用空载体发夹结构，在组织特异性启动子控制下表达含有非回文SfiI序列（GGCCATCTAGGCC）的序列。
   7. 使用增加的 hsp-70p::RFP 以报告基因的表达作为读出指标，对表达阳性转化子进行评分 hsp-90 发夹RNA干扰（图3）。为了更广泛地验证任何目的基因在特定组织中的敲低效果，可采用qRT-PCR检测整个生物体中该目的基因的mRNA水平。
   8. 整合表达肠道特异性外源染色体阵列的最终菌株 hsp-90 发夹结构（PVH2；参见 表1）通过γ射线辐照。关于将染色体外阵列整合到基因组中的方法，请参见²².
2. 通过喂食表达双链RNA的细菌实现组织特异性RNA干扰的组织特异性SID-1表达
   1. 亚克隆 sid-1 来自载体 TU867 的基因组 DNAunc-119p::SID-1)¹⁹ 进入Gateway入门载体pDONR221。用于克隆的引物 sid-1 DNA 可以在¹⁹. 融合 sid-1 含肌肉特异性启动子的pDONR221载体与Gateway入门克隆myo-3p）或肠道-（vha-6p）特异性启动子和 unc-54 3’非翻译区 （或根据1.1.4节所述方法，选择其他任意3'非翻译区）进行Gateway反应。
   2. 显微注射所得 vha-6p::SID-1::unc-54 3’非翻译区 或 myo-3p::SID-1::unc-54 3’非翻译区 浓度为 30 ng/µL 的构建体，与红色荧光咽部共注射标记物（例如， myo-2p::RFP；5 ng/µL）加入到 sid-1(pk3321) 突变体。
   3. 整合染色体外的肠道或肌肉特异性表达元件 sid-1 如所述将阵列插入基因组²²。此处获得了菌株 PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) 和 PVH65vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321)
   4. 用于神经元特异性表达的 sid-1 在 sid-1(pk3321) 突变体，使用菌株 TU3401 uIs3401[unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP];sid-1(pk3321) 由 Calixto 等人先前生成¹⁹.
   5. 如1.1.7节所述，通过qRT-PCR检测目标基因的mRNA水平，以确认目的基因在特定组织中的敲低效果。或者，可通过在同一组织中表达荧光蛋白（如GFP或RFP）并用GFP或RFP RNAi处理线虫，来验证该组织对RNAi的敏感性。将线虫以同步化的L1期幼虫阶段暴露于GFP/RFP RNAi，并在RNAi细菌上培养至成虫第1天见 图2）。在本实验中，我们使用了在神经元、肌肉或肠道中表达 SID-1 的品系，并将其与在神经元（AM987）、肠道（AM986）或肌肉（AM988）中表达 HSP-90::RFP 的品系进行杂交。

2. 利用应激报告基因和蛋白质稳态传感器监测细胞自主性和非细胞自主性蛋白质稳态

注意：为了监测特定组织中的蛋白质稳态能力，应使用组织特异性的蛋白质稳态传感器（例如在肠道中表达 Q44 或在肌肉中表达 Q35 的品系——参见表 3）以及应激报告基因（例如热诱导的hsp-70p::mCherry报告系统；表 3）。

1. 将 sid-1 (pk3321) 突变等位基因与蛋白稳态传感器品系进行遗传杂交，并通过饲喂RNAi确认sid-1(pk3321)的存在
   1. 将蛋白稳态传感器/应激报告品系与sid-1 (pk3321)突变品系的遗传背景进行遗传杂交。如需建立不同转基因品系之间的遗传杂交，请参照²³获取详细方案。
      注意：sid-1(pk3321) 突变体对饲喂RNAi具有抗性，因此用针对必需基因（如elt-2或hsp-90）的RNAi处理胚胎时，仅在sid-1基因杂合或野生型的品系中导致发育停滞或幼虫致死。
   2. 将10只性成熟的雌雄同体线虫置于含elt-2或hsp-90 RNAi的平板以及对照（空载体；EV）RNAi平板上，在20 °C下产卵。1–2小时后移除母本。以N2 Bristol品系和sid-1(pk3321)突变体作为对照。
   3. 在接下来的2–3天内观察RNAi平板上幼虫的发育情况。elt-2 RNAi将导致L1幼虫停滞，而hsp-90 RNAi将导致N2 Bristol品系出现L3幼虫停滞。sid-1突变体不受RNAi处理影响，将正常发育为性成熟的成虫。
      注意：C. elegans中sid-1(pk3321)纯合子将表现为均一的群体并全部发育至成虫阶段。杂合子则表现为混合群体，部分个体出现幼虫停滞，部分个体发育为成虫。
2. 通过基因分型确认sid-1(pk3321)的存在
   1. 挑选15–20条选定候选F2品系的线虫，放入含有15 µL线虫裂解缓冲液的PCR管中（表2）。
   2. 将PCR管置于-80 °C下至少10分钟或过夜。
   3. 将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行孵育：
   4. 65 °C孵育60分钟（裂解线虫）；95 °C孵育15分钟（灭活蛋白酶K）；4 °C保存。
   5. 取2 µL线虫裂解液作为“模板”，使用以下引物对sid-1进行PCR基因分型：sid-1 forw：5’-agctctgtacttgtattcg-3’ 和 sid-1 rev：5’-gcacagttatcagatttg-3’。
   6. PCR基因分型程序如下：95 °C预变性3分钟，1个循环；随后进行30个循环：95 °C变性10秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸30秒；最后72 °C延伸10分钟，1个循环，4 °C保存。
   7. 使用PCR纯化试剂盒（材料表）纯化约650 bp的PCR产物，并对sid-1 PCR产物进行测序，以鉴定sid-1 (pk3321)等位基因中的G-to-A点突变。或者，该G-to-A点突变可产生ApoI限制性酶切位点，可用于PCR产物的基因分型，具体方法见²⁴。
3. 使用iQ44::YFP作为肠道蛋白稳态传感器
   1. 通过漂白法同步表达肠道Q44::YFP的C. elegans（品系OG412），或将该品系与sid-1(pk3321)突变背景进行杂交后同步，具体操作参照²⁵所述方案。将同步后的L1幼虫接种至含OP50细菌的9 cm线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上，在20 °C下培养至L4期。
   2. 用5 mL M9缓冲液冲洗平板上的L4期线虫，收集线虫。使用玻璃移液管或经硅化处理的塑料移液管将含有L4线虫的M9缓冲液转移至15 mL离心管中，在室温下以1000 x g离心1分钟，使线虫轻柔沉淀。小心移除上清液，确保不扰动线虫沉淀。
   3. 关键步骤：转移或接种线虫时，应使用经硅化剂（如SigmaCote）处理的玻璃移液管或塑料移液枪头，具体操作遵循制造商说明。此举可防止线虫黏附于移液枪头的塑料表面。
   4. 重复步骤2.3.2三次，以彻底洗去线虫表面附着的所有OP50细菌。
   5. 将线虫沉淀重悬于5 mL M9缓冲液中，计数10 µL悬浮液中的线虫数量。
   6. 将L4期线虫以每板10条的密度接种至含空载体对照（EV）或hsp-90 RNAi细菌的6 cm NGM琼脂平板上（每个时间点和生物学重复准备5个平板），在20 °C下培养24–48小时。
   7. 在24小时（=第1天成虫）和48小时（=第2天成虫）后，统计表现出聚集体的线虫肠道中Q44斑点的数量。每个生物学重复至少计数30–50条线虫。

3. 组织特异性候选RNAi筛选调控细胞非自主蛋白质稳态的因子

注意：在组织特异性RNAi筛选中，我们使用了菌株PVH172，该菌株可通过喂食RNAi细菌实现肠道特异性RNAi；同时使用了菌株PVH171，该菌株可实现肌肉特异性RNAi（基因型见表1）。

1. 候选RNAi平板的制备
   1. 根据标准方法制备添加有100 µg/mL氨苄青霉素、12.5 µg/mL四环素和1 mM IPTG的6 cm NGM琼脂平板²⁵.
   2. 使用Ahringer RNAi文库获取RNAi筛选的候选RNAi克隆²⁰.
   3. 用塑料移液枪头将目的RNAi克隆接种于含氨苄青霉素（50 µg/mL）的3 mL LB培养基中，置于15 mL离心管内。37 °C振荡过夜培养。
   4. 次日，向细菌过夜培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（来自1 M储备液），使其终浓度为1 mM。
   5. 在37 °C下继续振荡培养3小时。
   6. 将300 µL细菌RNAi培养物接种至含100 µg/mL氨苄青霉素、12.5 µg/mL四环素和1 mM IPTG的6 cm NGM琼脂平板上。将平板置于室温下，避光（用铝箔覆盖），在实验台上晾干2天。晾干后，RNAi平板可置于4 °C保存数周。
2. 同步化 秀丽隐杆线虫 以及用RNAi细菌进行处理
   1. 为同步线虫品系，挑选15只带有卵的成虫至RNAi平板，让其产卵1小时，随后移除平板上的成虫。
   2. 关键步骤：本实验避免使用漂白法进行同步，因为该方法可能诱导 hsp-70p::RFP 报告基因，因为这是一种应激条件 秀丽隐杆线虫.
   3. 挑选同步化的L4期幼虫并转移至新的RNAi平板中。
   4. 让线虫在相应的RNAi培养基上生长两代，以确保高效摄取dsRNA，并保持温度为20 °C。
   5. 用于成像和 hsp-70p::RFP 荧光定量，使用第1天的成虫。
3. 显微镜载玻片的制备
   1. 在载玻片上加入约 250 µL 2% 琼脂糖溶液（溶于 M9 缓冲液），再将另一张载玻片盖在上方，压制成平整的圆片。
   2. 在已制备的琼脂糖垫上加入5 µL 5 mM 左旋咪唑溶液（溶于M9缓冲液），并将5条1日龄成虫线虫转移至左旋咪唑液滴中。让线虫静置5分钟以实现麻痹。
   3. 一旦 秀丽隐杆线虫 用铂金丝小心调整麻痹的线虫位置，并在加盖盖玻片前用实验室擦拭纸去除多余的左旋咪唑。
   4. 关键步骤： 确保在制备显微镜载玻片后30分钟内完成线虫的成像。显微镜载玻片上的麻痹线虫可能因干燥而破裂，从而影响荧光信号的测量。
4. 显微镜设置与图像分析
   注意：图像采用配备 EM-CCD 相机和显微成像自动系统的共聚焦显微镜获取 & 图像分析软件。
   1. 使用561 nm激光在10倍放大下采集RFP荧光激发图像。确保所有图像均采用相同的激光功率、针孔大小和荧光增益设置，以便进行比较。
   2. 将所有图像保存为TIFF文件。
   3. 使用 ImageJ 进行图像分析。测量每张图像中单位面积的荧光强度（以每单位面积的像素数表示），并扣除背景荧光。将每张图像的荧光强度归一化至图像面积以及线虫的长度。
   4. 使用平均强度测量 分析 | 测量 在 ImageJ 中，将所得的强度值除以图像面积，以对图像面积进行归一化。
   5. 为了将强度归一化至线虫体长，在 ImageJ 中沿虫体长度画一条线并进行测量 分析 | 测量将荧光强度归一化至线虫体长的原因在于，线虫的大小可能因RNAi所敲低的基因不同而存在差异，而这种大小差异可能影响平均荧光强度。
   6. 将测得的荧光强度归一化至未处理对照组（即转基因） C. 秀丽杆线虫在对照（EV）RNAi平板上培养）。合并标准化后的数值，以比较每种RNAi条件下的平均荧光强度。每个生物学重复建议成像20条线虫，并至少收集3个生物学重复的图像。
   7. 使用学生t检验计算平均荧光强度值的P值，并采用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正，设定错误发现率为0.05。

结果

两种组织特异性RNAi方法：表达发夹结构或组织特异性SID-1互补
表达组织特异性的发夹RNAi构建体可实现基因在整个发育过程中的持续敲低。然而，当目标基因本身对特定组织的器官发生至关重要时，这种方法可能不切实际，例如elt-2基因，其对肠道发育必不可少²⁶。在RNAi抗性的sid-1突变体中实现组织特异性SID-1表达具有独特优势，即可以在发育的后期阶段精确控制组织特异性基因的敲低时间。在这两种情况下（无论是表达发夹构建体还是组织特异性SID-1互补），都需要验证组织特异性RNAi的效率，以确认仅有目标组织受到RNAi影响。这一验证可通过在不同组织中共同表达荧光标记蛋白（如与RFP融合的HSP-90（HSP-90::RFP））来实现。

我们将单独的 sid-1(pk3321) 突变体，或在神经元、肠道或体壁肌中表达 SID-1 的 sid-1 突变体，与在神经元（图 2A

讨论

本文所述方法展示了如何使用工具以组成型和时间特异性的方式实现对特定组织中 PN 组分的敲低。我们此前已鉴定出 TCS，这是一种由特定组织中 Hsp90 表达水平改变所诱导的细胞非自主性应激反应机制¹⁰。通过表达发夹 RNAi 在特定组织中敲低 hsp-90，可导致远端组织中保护性分子伴侣 hsp-70 的表达发生细胞非自主性上调，从而增强整个生物体的应激抗性¹⁰。然而，我们尚不清楚在感知应激或响应应激的组织中，哪些信号组分被激活以启动这一保护性反应。为了鉴定介导该过程的信号组分，组织特异性的反向遗传学筛选是重要的首选方法之一。

尽管通过表达发夹结构实现组织特异性基因敲低是有效的，但在需要检测大量基因时，这种方法存在缺点。利用RNAi抗性的sid-1突变体，并通过在肠道、神经元或肌肉中表达SID-1进行回补，可实现通过喂食RNAi进行组织特异性的基因敲低，因此该系统适用于组织特异性的遗传筛选。本文中我们描述了一个针对58个候选基因的小规...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素	默克	A0166-5G	第3.1节 实验方案
DNA 纯化 & 浓缩仪-500	Zymo Research	D4031	第2.2节 实验方案
IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷β-D-硫代半乳糖苷	默克	367-93-1	第3.1节 实验方案
Multisite Gateway 克隆试剂盒	赛默飞世尔科技	12537100	第1.2节 实验方案
SigmaCote	默克	SL2-25mL	第2.3节 实验方案
四环素	默克	T7660-5G	第3.1节 实验方案
Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒	赛默飞世尔科技	K280002	第1.1节 实验方案