不溶性蛋白质聚集的定量分析 秀丽隐杆线虫 采用新型数据非依赖性采集工作流程研究衰老过程

摘要

该新型工作流程仅需少量起始材料，即可高效提取并分离秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中十二烷基硫酸钠（SDS）不溶性蛋白质（不溶性蛋白质组，insolublome），用于定量差异蛋白质组学分析。本方案采用全面的数据非依赖性采集质谱分析技术对不溶性蛋白质组进行定量，并结合生物信息学分析，以深入理解衰老机制及相关病理过程。

摘要

我们及其他研究者已证实，衰老过程会导致全蛋白质组范围内不溶性蛋白的累积。在超过40%的情况下，敲低编码这些不溶性蛋白的基因可延长寿命 C. elegans，表明这些蛋白质中的许多是衰老过程的关键决定因素。分离并定量鉴定这些不溶性蛋白质，对于理解衰老过程中发生的关键生物学过程至关重要。本文介绍了一种经过修改和优化的实验方案，详细说明了如何从样品中提取和分离SDS不溶性蛋白质（不溶性蛋白质组，insolublome）。 C. elegans 更高效地通过一种新型无标记定量蛋白质组学分析来简化质谱工作流程. 该改进方案采用高效超声破碎仪进行线虫裂解，显著提高了蛋白质提取效率，使起始材料用量大幅减少（约3,000条线虫），远低于以往方案（通常至少需要40,000条线虫）。随后对不溶性蛋白组（insolublome）进行定量蛋白质组学分析，采用数据依赖性采集（DDA）进行蛋白质发现与鉴定，以及数据非依赖性采集（DIA）实现更全面且精确的蛋白质定量。对定量所得蛋白质进行生物信息学分析，可获得潜在候选分子，便于后续结合其他分子生物学方法开展深入研究 C. elegans 通过该工作流程，我们通常可鉴定出超过 1000 种蛋白质，并定量超过 500 种蛋白质。该新方案可实现高效的化合物筛选 C. elegans在此，我们验证并应用了这一改进后的方案于野生型 C. elegans N2-布里斯托尔品系，并确认10日龄的第1天 N2 与第2天的年轻线虫相比，线虫的不溶性蛋白组积累更多。

引言

随着衰老的进程，蛋白质稳态逐渐下降，导致蛋白质聚集增加^1,2,3。蛋白质聚集与多种神经退行性疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症⁴。衰老被认为是与蛋白质聚集相关的神经退行性疾病发生的主要风险因素。易于形成不溶性聚集体的蛋白质常与细胞毒性及组织功能障碍相关，这可能进一步加速其他蛋白质的聚集^5,6,7。此外，不溶性蛋白质聚集体可能激活细胞防御机制，以清除系统中有毒的蛋白质寡聚体形式。在与年龄相关疾病及正常衰老的背景下，敲低编码不溶性蛋白质的特定基因可调节秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans ，C. elegans）的寿命^5,8,9。因此，研究蛋白质聚集的细胞与分子机制对于理解衰老过程至关重要，并最终可能为治疗神经退行性疾病提供策略。

由于具有寿命相对较短（约2周）、易于培养和遗传操作等独特特性，线虫C. elegans已成为研究衰老及衰老相关疾病中蛋白质聚集的最广泛应用的模式生物之一。

提取和表征不溶性蛋白质的能力在确定与C. elegans模型中蛋白质聚集相关的衰老变化方面发挥了关键作用。为了研究蛋白质聚集对正常衰老过程的贡献，我们⁵及其他研究者²此前分别提取并进行了蛋白酶消化，分析了年轻与年老C. elegans的不溶性蛋白质组（insolublome），使用iTRAQ试剂（“用于相对和绝对定量的同重标记”）进行化学标记，随后采用基于质谱（MS）的方法进行定量。通过同重标记方法并使用120 mg湿重线虫（约40,000条），我们能够获得显著的不溶性蛋白质组深度和覆盖度⁵。定量分析显示，在鉴定出的1200种蛋白质中，有203种在年老C. elegans的不溶性蛋白质组中显著富集，相较于年轻线虫的相应不溶性组分⁵。独立地，David等人也采用iTRAQ LC-MS/MS工作流程研究了正常衰老过程中蛋白质聚集体的变化²。他们起始使用约300 mg线虫样本，通过两个生物学重复实验鉴定出约1000种不溶性蛋白质，并发现其中约700种蛋白质随年龄增长其含量累积达到1.5倍或更高，相较于年轻线虫²。总体而言，这些独立研究结果表明，广泛的蛋白质不溶性和聚集是正常衰老的固有特征，可能影响寿命以及神经退行性疾病的发生率^2,5。

对不溶性蛋白质组的研究使我们能够确定环境因素如何加速或延缓衰老过程。Klang 等人建立了在 C. elegans 中无需标记的蛋白质组学工作流程，以研究金属稳态在长寿中的作用¹⁰。在该研究中，至少使用了 40,000 条线虫来提取不溶性蛋白质组¹⁰。数据显示，铁、铜、钙和锰的水平随衰老而升高，给线虫喂食高铁饮食会显著加速与年龄相关的不溶性蛋白质的积累¹⁰。利用相同的工作流程研究维生素 D 对 C. elegans 不溶性蛋白质组的影响时，在年轻线虫（第 2 天）中定量到 38 种蛋白质，在老年线虫（第 8 天）中定量到 721 种蛋白质。补充维生素 D 显著将老年线虫的不溶性蛋白质组从 721 种减少至 371 种¹¹。进一步研究表明，补充维生素 D 可抑制随年龄增长出现的蛋白质不溶性，促进蛋白质稳态，并延长 C. elegans N2 野生型线虫的寿命¹¹。因此，研究不溶性蛋白质组有助于发现衰老及衰老相关疾病的新调控因子。

尽管对不溶性蛋白质组（insolublome）的研究极大地推动了人们对衰老过程的理解，但该研究一直受限于需要大量起始样品。Groh 等人最近提出了一种无标记的蛋白质组定量工作流程，用于研究 C. elegans 在衰老过程中固有的蛋白质聚集变化；然而，该方法需要大量的起始材料（350 mg 粉碎的线虫）¹²。在本报告中，我们建立了一种改进的新型提取与分离方案（图 1）。在裂解线虫时使用高效超声波破碎仪显著提高了提取效率，从而将所需起始材料的数量从 40,000 条减少至 3,000 条线虫。将这种新型的不溶性蛋白质组分离方案与无标记的数据非依赖性采集（DIA）质谱工作流程相结合，显著提升了蛋白质的检测深度和覆盖度。本文所述方案成本低廉，且易于修改，可用于在其他模式系统中开展不溶性蛋白质组分析。 

方案

注意：为更好地理解实验步骤，请参见图1中的工作流程示意图。

1. 同步衰老的大规模培养 C. elegans

1. 平板准备
   1. 将30 mL NGM琼脂（含或不含50 mM氟脱氧尿苷（FUdR））倒入每个90 mm培养皿中，在超净台中干燥2天。
   2. 在接种NGM琼脂平板的前一天，将50 µL冷冻甘油保存的OP50菌株样品接种至2 L锥形瓶中的1 L预灭菌LB培养基中。
   3. 在37 °C、250 rpm振荡培养箱中培养细菌16小时。
   4. 培养16小时后，以5,000 × g 离心10分钟。
   5. 弃去上清液，并将菌体沉淀完全重悬于40 mL灭菌S-基础溶液（含50 mM K₃PO₄、100 mM NaCl的水溶液）中，制备25倍浓缩的OP50 E. coli 菌液。
   6. 将2 mL 25倍浓缩菌液均匀涂布于每块NGM琼脂平板表面，确保覆盖整个琼脂表面。
   7. 在细菌培养超净台中打开平板盖，晾干2–3小时，直至平板充分干燥。
      注意：每15分钟轻轻旋转平板一次，以确保细菌均匀分布。此步骤至关重要，因为细菌容易聚集在平板一侧，导致局部细菌密度偏低。
   8. 平板干燥后盖上盖子，室温放置48小时，确保OP50 E. coli 食物源完全干燥。
      注意：平板可提前2周制备，使用前于4 °C保存。
2. C. elegans 同步化群体的维持与制备
   1. 为获得用于分离SDS不溶性组分所需的蛋白裂解液（1.0–1.5 mg），每个样品需使用约3,000条同步化的线虫。
   2. 将约100条N2野生型产卵成虫转移至NGM 25倍OP50 E. coli 接种平板，于20 °C培养约72小时，直至平板上充满产卵成虫。
   3. 向每块平板中加入约10 mL S-基础溶液，用移液器将所有线虫收集至15 mL离心管中。
      注意：在此步骤及后续所有涉及线虫收集的操作中，必须使用低吸附枪头或巴斯德移液管，以防止线虫附着在枪头表面造成损失。
   4. 样品以520 × g 离心30秒，弃去上清液。为彻底去除OP50 E. coli，向沉淀中加入10 mL S-基础溶液，再次离心并弃去上清液。重复此步骤一次。
   5. 向15 mL锥形管中的线虫沉淀加入10 mL次氯酸钠漂白液（含0.5 M KOH和0.48%次氯酸钠的水溶液），室温剧烈涡旋振荡2分钟。
   6. 室温下以520 × g 离心30秒，使未完全溶解的线虫残体和虫卵沉淀，随后弃去上清液。
   7. 重复步骤1.2.5和1.2.6，以确保完全去除线虫残体并释放虫卵（可在显微镜下观察确认）。
   8. 用10 mL S-基础溶液至少洗涤虫卵沉淀4次，确保完全去除漂白液。
      注意：必须彻底去除残留漂白液，否则可能抑制虫卵孵化。
   9. 将虫卵重悬于5 mL S-基础培养基中，置于15 mL离心管内，于20 °C旋转培养24小时，使虫卵孵化。
   10. 24小时后，取10 µL S-基础幼虫溶液计数其中线虫数量。至少取三个独立的10 µL S-基础幼虫溶液样品进行重复计数，计算三次幼虫浓度的平均值。根据平均浓度，将幼虫溶液稀释至每200 µL溶液中含约3,000条幼虫。
       注意：计数前应轻轻颠倒混匀离心管，因为幼虫静置后易沉降，影响计数准确性。
   11. 充分混匀后，将200 µL S-基础幼虫溶液滴加至每块90 mm NGM细菌接种平板上。
       注意：应将S-基础幼虫溶液均匀滴加在平板不同位置，以确保幼虫分布均匀，避免局部细菌被过度消耗。
   12. 待S-基础溶液干燥后，将平板倒置于20 °C培养箱中培养48小时。
   13. 48小时后，用S-基础溶液将线虫从平板上洗下，并转移至含有50 mM FUDR的新鲜NGM接种平板，于20 °C继续培养。
       注意：应在L4期早期转移线虫，以确保FUDR的有效性。
   14. 48小时后（即第2天年轻成虫阶段），向平板中加入10 mL S-基础溶液，将线虫转移至15 mL离心管中。静置使线虫自然沉降，待上清液变澄清后弃去S-基础溶液。
   15. 用5 mL S-基础溶液洗涤线虫沉淀2–3次，以去除附着的细菌。尽可能吸尽S-基础溶液，将线虫沉淀（置于15 mL离心管中）在干冰/乙醇浴中速冻。冷冻样品保存于-80 °C。
   16. 每隔一天将样品线虫转移至含FUDR的新鲜NGM OP50 E. coli 平板，直至第10天。按照步骤1.2.14和1.2.15所述方法收集并冷冻线虫。
       注意：第10天样品应起始使用较多数量的线虫，以补偿因转移和钻入行为造成的线虫损失。

2. 从线虫中提取SDS不溶性组分

1. 在冰上解冻冻存的线虫沉淀，加入900 µL预冷的线虫裂解缓冲液混合液，缓冲液成分为20 mM Tris碱（pH 7.4）、100 mM NaCl、1 mM MgCl₂以及不含EDTA的蛋白酶抑制剂。短暂涡旋振荡样品，确保线虫沉淀在裂解缓冲液中完全重悬。
2. 将15 mL离心管放入超声破碎仪水浴中，设置高强度超声处理10个循环（每个循环30秒开启，30秒关闭）。可重复最多五次（确保线虫完全裂解）。
3. 在4°C条件下，以3,000 x g离心4分钟。离心后弃去含有线虫残渣的沉淀，小心将上清液转移至冰上预冷的新1.5 mL离心管中。
4. 使用BCA法测定蛋白浓度。将通常含有约1 mg蛋白的裂解液分装至新的预冷1.5 mL离心管中。
5. 在4°C条件下，以20,000 x g对蛋白裂解液离心15分钟。
6. 小心移取上清液至新的1.5 mL离心管中，避免扰动沉淀，将上清液保存为水溶性蛋白组分。
7. 用500 µL室温下含1% SDS的线虫裂解缓冲液洗涤上一步所得沉淀，室温下以20,000 x g离心15分钟。弃去上清液并保存为SDS可溶性组分。重复此洗涤步骤两次，以彻底去除残留的SDS可溶性组分。第三次洗涤后剩余的沉淀定义为1% SDS不溶性蛋白组分。
8. 将SDS不溶性蛋白沉淀重悬于60 µL 70%甲酸中，并剧烈涡旋振荡以溶解蛋白。根据需要多次剧烈涡旋，直至沉淀完全溶解。
9. 在室温下将沉淀置于超声水浴中处理30分钟。
   注意：SDS不溶性沉淀通常难以溶解于缓冲液中，但最终在此步骤中应完全溶解。
10. 使用真空浓缩仪干燥样品1小时，以彻底去除甲酸溶液。
11. 向干燥后的沉淀中加入40 µL 1x LDS上样缓冲液，95 °C加热10分钟。短暂涡旋并离心收集样品。取13 µL上样至4-12% NUPAGE Bis-Tris凝胶进行电泳。使用荧光蛋白染料染色凝胶用于成像。剩余样品保存用于质谱（MS）分析。
12. 将剩余样品上样至4-12% Bis-Tris凝胶，电泳约20分钟，用于质谱凝胶内酶解分析。

3. 使用胰蛋白酶进行胶内消化以分离用于质谱分析的蛋白质

1. 配制以下新鲜溶液：25 mM NH₄HCO₃ （pH 7–8）、含50%乙腈（ACN，pH 7–8）的25 mM NH₄HCO₃，以及含5%甲酸的50% ACN。
2. 将每块凝胶切成小片（通常 <1 mm²），放入0.65 mL硅化管中。
3. 加入约100 µL（或足以覆盖）25 mM NH₄HCO₃/50% ACN溶液，室温涡旋10分钟。吸出上清液并转移至另一管中（弃去）。重复此步骤两次。
4. 在真空浓缩仪中将凝胶完全干燥（约20分钟）。
5. 配制新鲜溶液，向干燥的凝胶中加入约100 µL（或足以覆盖）含10 mM DTT的25 mM NH₄HCO₃溶液（使用新配制的NH₄HCO₃）。涡旋混匀并短暂离心。在56 °C、1400 rpm振荡条件下反应1小时。
6. 移除上清液，向凝胶中加入100 µL含55 mM碘乙酰胺（IAA）的25 mM NH₄HCO₃溶液。涡旋混匀并短暂离心。避光、室温反应45分钟。
7. 移除上清液并弃去。加入约100 µL 25 mM NH₄HCO₃洗涤凝胶，涡旋10分钟。短暂离心后移除上清液，弃去。
8. 向凝胶中加入约100 µL（或足以覆盖）含50% ACN的25 mM NH₄HCO₃溶液，涡旋10分钟以脱水。短暂离心后移除并弃去上清液。重复此步骤两次，若凝胶仍未完全干燥（表现为凝胶体积较小且呈浑浊白色），可进行第三次。
9. 在真空浓缩仪中将凝胶完全干燥（约20分钟）。
10. 每份样品先加入15 µL胰蛋白酶溶液（含250 ng胰蛋白酶），再加入足量25 mM NH₄HCO₃以完全覆盖凝胶（约100 µL）。涡旋10分钟，短暂离心后，在4 °C冰箱中静置孵育30分钟（不混匀）。
11. 根据需要加入25 mM NH₄HCO₃，确保完全覆盖凝胶。短暂离心后，在37 °C、1400 rpm振荡条件下过夜孵育16–20小时。
12. 次日，短暂涡旋并离心消化产物。加入约100 µL HPLC级水，短暂离心，用封口膜封管，持续超声10分钟。超声后短暂离心。
13. 将消化液（代表水相提取物）转移至洁净的0.65 mL硅化管中。
14. 向凝胶中加入约100 µL含50% ACN/5%甲酸的溶液（足以覆盖凝胶），室温涡旋10分钟，短暂离心后收集溶液，重复一次。将本步骤及前一步3.13中所有含提取肽段的溶液合并至同一管中。
15. 涡旋混匀提取后的消化液。在真空浓缩仪中将肽段完全干燥（约2小时）。
16. 加入30 µL 0.2%甲酸，在4 °C冰箱中于振荡器上重悬肽段，持续10分钟。
17. 室温下以1850 x g离心5分钟。吸取肽段溶液转移至新的洁净0.65 mL硅化管中。随后使用C18脱盐柱对肽段溶液进行脱盐处理（见下文）。

4. 使用 C18 脱盐小柱对消化后的肽段进行脱盐

1. 将移液器调至 10 µL，并安装 C18 脱盐小柱。用移液器吸取 10 µL 的 100% ACN，然后弃去，以润洗脱盐小柱。重复此步骤 2 次。
2. 用移液器吸取 10 µL 的 50% ACN、49.8% 水和 0.2% FA，然后弃去，以洗涤 C18 脱盐小柱。重复此步骤 2 次。
3. 用移液器吸取 10 µL 含 0.2% FA 的水溶液，然后弃去，以平衡 C18 脱盐小柱。重复此步骤 2 次。
4. 将移液器调至 10 µL，通过将消化后的肽段溶液在树脂中上下移液 15 次，将肽段加载到树脂上。
   注意：重复操作可确保所有肽段与脱盐小柱的树脂充分结合。
5. 用移液器吸取 10 µL 含 0.2% FA 的水溶液，然后弃去，以对结合在树脂上的消化肽段进行脱盐。重复此步骤 4 次，完成脱盐步骤。
6. 在新的离心管中，加入 10 µL 含 50% ACN、49.8% 水和 0.2% FA 的溶液，通过上下移液 10 次洗脱肽段。重复此步骤一次，使蛋白消化产物在同一只管中进行第二次洗脱。
7. 在真空浓缩仪中将脱盐后的肽段完全干燥（约 20 分钟）。
8. 将肽段重悬于 15 µL 含 0.2% FA 的溶液中，并加入 1 µL iRT（保留时间索引）肽段。涡旋振荡 10 分钟，以 12,000 × g 离心 2 分钟，然后转移至自动进样瓶中用于质谱分析（见下文）。

使用 DDA 和 DIA 对消化后的肽段进行质谱分析

注意：样品可采用 DDA 或 DIA LC-MS/MS 方法进行分析。本研究中，样品使用与高分辨率质谱仪联用的纳米液相二维高效液相色谱系统进行分析。

1. 使用高效液相色谱系统（HPLC）与芯片式HPLC系统联用，并直接连接四极杆飞行时间质谱仪（也可使用其他LC-MS配置和系统）。
2. 采用反相HPLC-ESI-MS/MS分析样品。
   1. 建立色谱程序，将肽段样品加载至C18预柱芯片上。使用加载溶剂（0.1%甲酸）以2 µL/min的流速洗涤并脱盐已加载的肽段 ，持续10分钟。
   2. 将肽段转移至C18分析柱芯片，并以300 nL/min的流速，使用流动相A（2%乙腈，0.1%甲酸）和流动相B（98%乙腈，0.1%甲酸）进行3小时梯度洗脱。第一阶段洗脱为线性梯度，流动相B从5%升至35%，历时80分钟。
   3. 在5分钟内将流动相B升至80%，保持80%流动相B 8分钟，随后切换回5%流动相B，重新平衡色谱柱25分钟。
3. 设置质谱仪的DDA方法，并按以下要求定义仪器参数。
   1. 实验1使用以下参数：MS1母离子扫描范围为m/z 400–1500（累积时间为250 ms）；设定触发MS/MS扫描的离子电荷态2–5的强度阈值为200计数；设定母离子动态排除时间为60秒。
   2. 实验2使用以下参数：MS/MS产物离子扫描，每个循环进行30次产物离子扫描，MS2扫描范围为m/z 100–1500（每次扫描累积时间为100 ms）；设定碰撞能量扩散为CES=5，并勾选“高灵敏度产物离子扫描模式”。
      注：DDA采集方法用于构建谱图库，具体见步骤6.3（见下文）。此处，每个循环在每次MS1扫描后采集丰度最高的30个母离子的MS/MS谱图；总循环时间约为3.3秒。
4. 进行DIA分析。设置质谱仪的DIA方法，并按以下要求定义仪器参数。
   1. 实验1使用以下参数：MS1母离子扫描范围为m/z 400–1250（累积时间为250 ms）。
   2. 实验2使用以下参数：MS/MS产物离子扫描，共64个可变SWATH窗口，MS2扫描范围为m/z 100–1500（每个循环进行64次产物离子扫描，每次扫描累积时间为45 ms）；设定碰撞能量扩散为CES=10，并勾选“高灵敏度产物离子扫描模式”。
      注：采用Schilling等人¹³描述的64个可变窗口DIA/SWATH采集方法进行非标记定量分析，总循环时间约为3.2秒。在DIA采集过程中，不同于DDA中使用Q1四极杆仅传输窄质量范围的母离子进入碰撞池，而是采用一系列宽度可变的窗口（例如m/z 5–90），通过64个SWATH窗口逐步覆盖完整的m/z范围（m/z 400–1250），每个窗口累积时间为45 ms，整个循环时间为3.2秒，其中包括一次累积时间为250 ms的MS1扫描。窗口宽度根据在特定m/z范围内观察到的典型MS1离子流复杂性，使用SCIEX“可变窗口计算器”算法¹³进行调整（在离子密集的m/z范围使用较窄窗口，在洗脱母离子较少的m/z范围使用较宽窗口）。在其他质谱平台上，也可采用不同的DIA窗口选择策略。

6. 数据分析

注意：某些数据分析设置应根据具体的实验条件进行调整。例如，所选择的蛋白质数据库（fasta 文件）将取决于样本来源的物种（在本方案中，我们使用了 C. elegans）。

1. 使用MS数据库搜索引擎分析DDA采集数据并鉴定蛋白质。生成数据库搜索引擎方法如下：
   1. 在样本描述参数中，选择鉴定；在样本类型下，选择碘乙酸；在半胱氨酸烷基化下，选择胰蛋白酶；在消化（假设在赖氨酸和精氨酸的C端裂解）下，选择仪器中的质谱仪名称；在物种下选择Caenorhabditis elegans。
   2. 在特定处理参数中，勾选生物学修饰；在鉴定重点下选择SwissProt；在数据库下勾选彻底鉴定 ID；在搜索努力程度下，在检测蛋白阈值中选择0.05（10%）；在结果质量下勾选运行错误发现率分析。保存搜索引擎方法，并使用生成的方法将质谱原始文件提交至数据库搜索引擎进行处理。
      注：在迭代过程中，搜索引擎会根据初始注释和结果自动重新校准所有MS和MS/MS扫描。
2. 搜索完成后，点击导出肽段汇总，并在Excel中以99的置信度阈值（错误发现率（FDR）= 1%）筛选所有肽段鉴定结果。
3. 构建MS/MS谱图库，用于进一步处理DIA原始数据文件及后续相对定量分析。
   1. 打开DIA定量分析软件，选择谱图库选项卡，然后（在页面底部）点击从“数据库搜索引擎”生成谱图库，并打开在DDA原始数据文件数据库搜索过程中自动生成的“数据库搜索引擎”FDR报告（即*FDR.xlsx电子表格文件）。
   2. 点击下一步，选择谱图库设置模式，然后点击下一步。选择Uniprot_Caenorhabditis elegans _proteome作为数据库，然后点击完成，谱图库将被生成。
4. 使用DIA定量分析软件分析DIA采集数据，以实现全面的相对蛋白质定量。DIA数据分析流程如下所述。
   1. 为分析和定量肽段，打开DIA定量分析软件，使用模板模式设置分析方案。该模板模式可在软件中通过点击设置，然后选择DIA分析，最后选择BGS工厂设置获得。
   2. 在模板模式中设置参数如下：
      1）在鉴定下选择PTM定位（概率截断值 = 0.75）。
      2）在定量下，选择主组数量为肽段数量总和，设置主组N为最大7和最小1，选择次组数量为前体离子数量总和，设置次组N为最大10和最小1，选择数据过滤为Q值稀疏，不选择跨运行归一化。
5. 执行相对定量分析。
   1. 选择流程选项卡，点击从文件设置DIA分析，打开感兴趣的MS DIA原始文件（例如：样本和对照），点击分配谱图库，选择在6.3中生成的谱图库，点击加载，最后点击下一步。
   2. 选择在6.5.1中设置的分析模式，点击下一步。选择合适的数据库fasta文件（本方案中为Uniprot_Caenorhabditis elegans_proteome），点击下一步。定义实验条件设置，并根据样本分配不同条件，然后点击下一步。
   3. 查看分析概览（实验设置的摘要），浏览至输出目录，点击完成。最后点击运行流程以执行无标记定量分析。
      注：“DIA定量分析软件”中的统计模块会自动执行FDR分析，生成比较不同条件的热图和火山图，生成已鉴定和定量的肽段与蛋白质列表，并提供Q值以及不同条件间的相对倍数变化。本实验设置包括第10天的衰老线虫（两个生物学重复）和第2天的年轻线虫（两个生物学重复）作为对照。

结果

传统的线虫裂解方法存在多种缺点。例如，探针式超声法和珠击法因金属探针或珠子直接与样品接触而产生过多热量，导致蛋白质回收率不稳定以及蛋白质变性。液氮研磨后在裂解缓冲液中进行超声处理的方法则耗时较长，且需要大量线虫。由于传统线虫裂解方法的局限性，以往用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）模型系统以获取不溶性蛋白组定量信息的质谱工作流程，如iTRAQ标记法或非标记法，均需要大量的起始材料（至少40,000条线虫）。获得如此数量的线虫需要繁重的培养工作。此外，标记方法还需使用昂贵的同重化学标签。非标记定量方法成本较低，样品制备和标记步骤更简便直接，但为了达到足够的质谱分析覆盖度，仍需要显著更多的线虫数量。

我们所使用的超声波破碎仪能够在受控温度的水浴超声仪中同时裂解多个线虫样品，且避免交叉污染¹⁴，从而极大地提高了线虫裂解的效率和可重复性，显著减少了所需起始线虫材料的数量。通过结合高效的超声破碎方法与定量的无标记DIA质谱（MS）分析策略，我们能够使用约3,000条线虫稳健地定量老年和年轻线虫的不溶性蛋白质组（insolublome）。本文中，我们测试并验证了该实验方案的效率，并比较了野生型N2-Bristol C. elegans 线虫品系中老年与年轻个体的不溶性蛋白质组。我们应用该方案从约3,000条老年和年轻N2 C. elegans 线虫中提取和分离不溶性蛋白质组（每种条件设置两个生物学重复），随后采用四极杆飞行时间质谱仪或其他质谱系统，结合数据依赖性采集（DDA）和数据非依赖性采集（DIA/SWATH）模式进行蛋白质鉴定与定量分析。首先将不溶性蛋白质在Bis-Tris 4–12%梯度凝胶上进行电泳分析，以确定每个不溶性蛋白质组样品中的蛋白含量。如图2所示，来自N2老年线虫的不溶性蛋白质组样品（第2和第3泳道，生物学重复实验）中的蛋白含量明显高于来自N2年轻线虫的样品（第1和第4泳道，生物学重复实验）。

凝胶内消化后，通过高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）分析不溶性蛋白组的蛋白质谱。采用该实验流程，通常可鉴定出1000–1500种蛋白质，并以高重复性对SDS不溶性组分中的500–1,000种蛋白质进行定量（未发表数据）。本研究中，通过分析DIA数据并去除冗余，我们定量了N2-Bristol株线虫C. elegans不溶性蛋白组中的989种蛋白质：与年轻线虫（第2天）相比，在衰老线虫（第10天）的不溶性蛋白组中，有768种蛋白质显著富集，27种蛋白质显著减少，筛选标准为变化倍数至少1.5倍且Q值小于0.01（图3A）。如直方图所示（图3B），显著变化蛋白质的变化倍数呈正态分布。结果表明，衰老线虫的不溶性蛋白组显著富集：观察到的最大变化显示，老年线虫相对于年轻线虫，其不溶性蛋白组中蛋白质相对丰度高达592倍；另有32种蛋白质的相对丰度在老年线虫中较年轻线虫增加超过>250倍，表明不溶性蛋白组随年龄增长发生显著变化。

在提取出在衰老蠕虫中显著增加且通过 WormBase（WS271）鉴定的不溶性蛋白质列表后，进行了 KEGG 通路和基因本体（GO）分析，以确定在衰老不溶性蛋白质组中富集的通路，从而获得这些通路与衰老之间关联的生物学见解。本研究鉴定的蛋白质的 KEGG 通路分析显示，核糖体、线粒体、蛋白酶体和剪接体相关通路显著富集图 4A）。基因本体分析显示，来自老龄蠕虫的不溶性蛋白质组包含多个特定类别中的许多蛋白质，包括线粒体蛋白、发育相关蛋白、成体寿命决定因子以及核糖体蛋白（图4B 和 补充表 1A）。随后，我们将本研究中鉴定出的蛋白质列表与David等先前发表的研究结果进行了比较。² 和 Mark 等人¹¹ 如维恩图所示（图5A,5B）。比较结果显示，与David等人的研究相比，鉴定出的蛋白质有显著重叠，分别为394/721和444/721图5A）以及 Mark 等人（图5B）研究中分别揭示的生物学通路。本研究对不溶性蛋白质组进行KEGG分析所发现的生物学通路，过去也已被识别，从而验证了我们的方法学（补充表 1B这些通路和蛋白质的鉴定提示，它们可能作为候选靶点，用于进一步探究其在衰老过程中的生物学功能。

综上所述，使用高效的超声处理方法能够在温度控制良好且交叉污染减少的环境中同时裂解多个线虫样品，从而以显著减少的起始线虫材料获得高蛋白质覆盖率。将高效的超声处理方法与无标记DIA蛋白质定量工作流程相结合，为不溶性线虫蛋白质的定量提供了可靠且可重复的结果。

图1. 实验方案的工作流程。C. elegans 在不同天数进行培养和收集。使用超声破碎仪裂解线虫后，从裂解液中提取并分离出1% SDS不溶性蛋白质组分（不溶性蛋白组）。随后通过凝胶内胰蛋白酶消化对该不溶性蛋白组进行消化，并采用DIA质谱法进行定量，继而进行生物信息学分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. N2-Bristol 品系年轻与年老线虫不溶性蛋白组的 SDS-PAGE 凝胶图。 通过 SDS-PAGE 分析 N2-Bristol 品系年轻与年老线虫的不溶性蛋白组，以确定其中蛋白质的含量。使用荧光蛋白染料对 SDS-PAGE 凝胶进行染色，以显示蛋白质条带。第 1 和第 4 泳道：来自两个生物学重复实验的年轻 N2 线虫（第 2 天）的不溶性蛋白组。第 2 和第 3 泳道：来自两个生物学重复实验的年老 N2 线虫（第 10 天）的不溶性蛋白组。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 在老年与年轻不溶性蛋白组中显示出显著变化的候选蛋白质及其倍数变化分布。（A）老年与年轻N2-Bristol线虫不溶性蛋白组定量分析的火山图。绝对倍数变化>=1.5且Q值<0.01的候选蛋白以红色圆点表示。（B）老年与年轻线虫样本中显著富集的SDS不溶性蛋白质倍数变化分布的直方图。请点击此处查看该图的放大版本。

图4. KEGG通路与基因本体（GO）分析 (A) 根据第10天不溶性组分的KEGG通路分析 p-值，其中显著性最高的通路显示在顶部。 (B基因本体分析显示，老年线虫不溶性蛋白组在特定类别中富集了多种蛋白质，包括线粒体蛋白、发育相关蛋白、成年寿命决定因子以及核糖体蛋白。散点图视图将基因本体术语呈现在“语义空间”中，相似性越高的术语在空间中位置越接近。气泡的颜色反映 STRING 分析所得的 p 值，而气泡的大小则反映该基因本体术语在 UniProt-GOA 数据库中的普遍性。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5. 在第10天的不溶性蛋白质组中鉴定出的蛋白重叠，比较本研究与（A）David 等人² 和（B）Mark 等人¹¹ 的研究结果。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1 (与……相关 图4 和 图5). (A) 使用 STRING 数据库进行基因本体（生物过程）分析。 (B) 本研究鉴定出的蛋白质和KEGG通路详细列表，颜色编码表示其与已发表研究的重叠情况。 请点击此处下载该文件。

讨论

在本实验方案中，我们报告了一种改进的样品制备方法，用于从C. elegans中提取不溶性蛋白质。通过使用高效的超声波破碎仪替代传统的线虫裂解方法（如探头超声或珠磨法），我们提高了不溶性蛋白质的提取得率，并将无标记质谱分析所需的线虫数量从40,000条减少至3,000条。采用数据库搜索引擎对DDA数据进行蛋白质鉴定，并利用“DIA定量分析软件”及相应的DDA数据库搜索结果（导入由数据库搜索引擎生成的FDR文件报告）构建了C. elegans的谱图库。随后，使用“DIA定量分析软件”处理新获得的DIA数据集及所生成的谱图库，对衰老与年轻C. elegans的不溶性蛋白质组数据进行相对定量分析。

该实验方案中有多个关键步骤。C. elegans 的寿命较短，相较于哺乳动物细胞等其他真核生物，是研究衰老的理想体系；但在研究与衰老相关的现象时，获得一个同质的线虫群体至关重要。本方案中使用 FUDR 获得同步化衰老的线虫。必须在 L4 发育阶段早期就将线虫转移至含有 FUDR 的 NGM 平板上，以确保其有效性。使用高效超声破碎仪进行线虫裂解时，水浴温度必须设置为 4 °C，并采用 30 秒开启、30 秒关闭的间歇超声模式，以防止样品过热。完成第一轮共 10 个循环（10 分钟）的超声处理后，必须在显微镜下检查，以确认所有线虫均已充分裂解；若未达到裂解效果，则需增加超声循环次数。在进行胶内酶解过程中，每一块凝胶需切成适当大小的碎片（<1 mm²）——若切得过小，可能在样品制备过程中丢失；若过大，则可能导致酶解不充分。

所需起始材料的大幅减少显著降低了为获得不溶性蛋白质组分析样品而进行线虫培养的繁重工作量。然而，1% SDS 不溶性蛋白组分的提取与分离涉及多个洗涤步骤，且需要谨慎处理样品，以避免样品损失并确保结果的可重复性。所获得用于质谱分析的样品量仅足够进行约 3 次后续 DDA 和 DIA 分析，无法保存用于未来的实验。此外，尽管氟脱氧尿苷（FUdR）可能存在潜在的干扰效应¹⁵，我们仍采用了尽可能低的浓度以在线虫衰老过程中实现无菌化。未来的研究可通过使用无菌突变体或通过人工转移与收集线虫的方式，避免使用 FUdR。

使用高效超声波破碎仪进行线虫裂解，可有效提取不溶性蛋白组，实现良好的蛋白质覆盖度，并利用显著减少的线虫数量进行经济高效的无标记DIA质谱分析以定量不溶性蛋白组。该方法显著降低了工作量，使得每次实验能够筛选更多实验条件。此外，无标记质谱DIA工作流程成本较低，且在蛋白质深度和覆盖度方面可达到与标记方法（如iTRAQ、TMT或SILAC）相当的水平。C. elegans 模型是衰老研究的快速筛选系统。该工作流程可轻松修改并应用于本物种及其他生物体的衰老及年龄相关疾病研究。例如，在目前的研究中，我们正在将该工作流程应用于多种阿尔茨海默病（AD）C. elegans 模型中不溶性蛋白组和蛋白质稳态特征的分析，包括Abeta、tau以及双Abeta/tau线虫模型，并结合或不结合不同的药物干预，为未来的高通量药物筛选奠定基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
所用菌株
Escherichia coli OP50	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）
N2 (Bristol)	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）
缓冲液/溶液
NGM（线虫生长培养基）			配方：3 g/L NaCl，23 g/L 琼脂，2.5 g/L 胰蛋白胨，1 mM CaCl₂，5 mg/L 胆固醇，1 mM MgSO₄，25 mM KH₂PO₄
S-基础溶液			配方：5.85 g/L NaCl，1 g/L K₂HPO₄，6 g/L KH₂PO₄，加水至 1 L
次氯酸钠漂白液			配方：将 0.5 mL 5 N NaOH 与 1 mL 次氯酸钠（5%）混合，再用 H₂O 定容至 5 mL
材料/设备
琼脂	Difco 颗粒琼脂，BD Biosciences	90000-782
Bioruptor Plus 超声破碎仪	Diagenode，美国	B01020001
胆固醇	Sigma	c8503
2'-脱氧-5-氟尿苷	VWR	TCD2235
甘油	Millipore Sigma	356350-1000ML
LB 肉汤，Miller	Millipore Sigma	60801-450
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma	L4509-250G
氯化钠	Sigma	59888
M880 超声波清洗器，117 V，容量 5.5 加仑	VWR，美国	89375-458
硫酸镁	Sigma	M506
氯化镁	Sigma	208337
NGM 琼脂平板	VWR 一次性培养皿	25384-342
NuPAGE LDS 样品缓冲液（4X）	Thermo Fisher Scientific	NP0007
NuPAGE 蛋白凝胶，4-12%	Invitrogen	NP 0335BOX
蛋白酶抑制剂混合物（PIC）	Roche	11836170001
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225
次氯酸钠 5%	VWR	JT9416-1
SYPRO Ruby 蛋白凝胶染色剂	Thermo Fisher Scientific	S12000
质谱部分
乙腈，Burdick and Jackson LC-MS	Honeywell International Inc.，北卡罗来纳州夏洛特，美国	36XL66
Agilent Zorbax 300Extend C18 色谱柱	Agilent Technologies Inc.，加利福尼亚州圣克拉拉，美国	770995-902
碳酸氢铵	Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国	9830（1 kg）
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国	D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact 恒温混匀仪	Eppendorf AG，德国汉堡	T1317-1EA
甲酸	Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国	F0507-500ML
保留时间索引（iRT）校准肽标准品	Biognosys AG，瑞士苏黎世施利伦	Ki-3002-2
碘乙酰胺（IAA）	Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国	I1149-25G
甲醇，HPLC 级	Honeywell International Inc.，北卡罗来纳州夏洛特，美国	34885
Nano cHiPLC Trap ChromXP C18-CL，200 μm × 6 mm，3 μm，120 Å（前柱芯片）（200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL 芯片，3 μm，300 Å）	Sciex LLC，马萨诸塞州弗雷明汉，美国	804-00006
Nano cHiPLC ChromXP 75 μm × 15 cm，C18-CL，3 μm，120 Å（分析柱芯片）	Sciex LLC，马萨诸塞州弗雷明汉，美国	804-00001
正交四极-飞行时间（QqTOF）TripleTOF 6600 质谱仪	Sciex LLC，马萨诸塞州弗雷明汉，美国	按报价
ProteinPilot 5.0	Sciex LLC，马萨诸塞州弗雷明汉，美国	软件下载自 Sciex
Savant SPD131DDA Speedvac 浓缩仪	Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国	SPD131DDA-115
测序级冻干胰蛋白酶	Life Technologies	23225
Spectronaut	Biognosys AG，瑞士苏黎世施利伦	Sw-3001
SWATH 2.0 插件（集成于 PeakView 2.2）	Sciex LLC，马萨诸塞州弗雷明汉，美国	软件下载自 Sciex
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC 系统	Sciex LLC，Eksigent 分部，马萨诸塞州弗雷明汉，美国	型号 # 845
水，Burdick and Jackson LC-MS	Honeywell International Inc.，北卡罗来纳州夏洛特，美国	600-30-76
Waters 1525 二元 HPLC 泵系统	Waters Corp.，马萨诸塞州米尔福德，美国	WAT022939
Waters 2487 双波长紫外检测器	Waters Corp.，马萨诸塞州米尔福德，美国	WAT081110
Waters 717plus 自动进样器	Waters Corp.，马萨诸塞州米尔福德，美国	WAT022939
Waters Fraction Collector III 馏分收集器	Waters Corp.，马萨诸塞州米尔福德，美国	186001878