方法文章

开发一种在失血性心脏骤停猪模型中的选择性主动脉弓灌注系统

DOI:

10.3791/61573

2020年8月25日

本文内容

摘要

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验方案旨在演示一种用于转化研究的猪失血性心脏骤停模型以及专门构建的选择性主动脉弓灌注回路。

摘要

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出血是创伤后可预防性死亡的主要原因。对于心脏骤停患者,选择性主动脉弓灌注(SAAP)等血管内复苏技术正受到越来越多的关注。该技术通过胸主动脉球囊导管对冠状循环进行主动灌注,目前已接近临床应用阶段。然而,该技术较为复杂,在应用于人体之前,尚需在动物模型中进一步优化。本文介绍了一种采用定制SAAP系统治疗失血性心脏骤停的大型动物模型。

猪被麻醉并进行仪器连接,在实施脾切除术之后,开始进行受控的对数级失血。动物接受肝素化处理,流失的血液被收集到储血器中。一旦观察到心脏停搏,即通过体外循环将血液泵入氧合器,然后经由置于胸主动脉内的10 Fr球囊导管输送血液。

这导致了自主循环的恢复(ROSC),心电图和主动脉根部压力波形可证明这一点。该模型及配套的SAAP系统可实现从失血性心脏骤停中的标准化且可重复的复苏。

引言

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出血是导致大多数本可预防的创伤性死亡的原因1。在失血性休克的终末阶段,冠状动脉灌注减少,进而引发心脏骤停和死亡。目前的治疗策略——静脉输血和心脏按压——效果有限,因其未能解决冠状动脉灌注不足的问题。

SAAP 是一种基于导管的复苏技术,旨在通过将含氧复苏液体和药物直接输注至近端主动脉,灌注冠状动脉和脑循环,从而解决这一问题。有限的猪模型研究表明,在心室颤动和失血性心脏骤停后,该技术在恢复心脏活动方面展现出良好的效果2,3,4。然而,SAAP 的研究仍在进行中,该技术目前仍处于临床前阶段。

SAAP 存在若干技术挑战。通过导管以精确的灌注速率输送特定体积的灌注液至关重要,但目前尚无经 FDA 批准且可商业获得的导管可用于 SAAP。该技术需要一个特定的回路,能够在 SAAP 期间高效地储存、氧合并输送灌注液。本研究的目的是建立一种创伤性无脉电活动(PEA)心脏骤停动物模型,并构建一套可靠、定制的 SAAP 系统,用于在失血性动物研究中探索该工具的应用。

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方案

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本研究在马里兰大学巴尔的摩分校医学院教学设施(MSTF,美国马里兰州巴尔的摩市)进行,该设施由美国实验动物科学协会认证。研究方案经当地机构动物护理和使用委员会批准。

1. 动物选择与饲养

  1. 使用成年雄性猪(Sus Scrofa),体重为 60–80 kg。
  2. 动物抵达动物实验设施后,每只单独饲养于一个笼中,但应允许其与相邻笼中的动物进行互动。
  3. 动物至少饲养 48 小时以确保充分适应环境。自由饮水,并给予标准饮食,直至实验前一晚开始禁食,以降低插管期间发生误吸的风险。
  4. 定期监测动物,确认其健康状况良好。

2. 镇静与全身麻醉诱导

  1. 在动物仍处于饲养区域时,通过在耳后或臀肌处进行肌肉注射特拉唑(Telazol,4-5 mg/kg)和赛拉嗪(xylazine,1.8-2.2 mg/kg)使其镇静。
  2. 将动物从饲养区转运至手术室,并置于手术台上呈仰卧位。
  3. 将脉搏血氧仪探头置于动物耳部,将面罩戴在动物鼻部,并给予100%氧气中的异氟烷2, 直到下颌放松,以诱导麻醉。
  4. 使用喉镜插入气管插管(ET管)。操作时应保持下颌张开,拉出舌头,识别会厌,将喉镜尖端插入咽部,并将会厌从软腭处推开。将ET管经声门向前推进6–10 cm,然后相对于动物头部顶端将其旋转至向下弯曲的位置。
  5. 用空气充胀气管插管套囊至10 cm3用纱布带将气管插管固定在动物的吻部,并听诊动物胸部以确认导管位置正确。
  6. 通过热湿交换器将气管插管连接至机械通气机。
  7. 确认合适的机械呼吸机设置,以提供所需的吸入氧浓度2 30% 的呼气末二氧化碳,潮气量为每公斤体重 7-10 mL,呼吸频率为 10-15 次/分钟2 38–42 mmHg 的压力
  8. 使用1.5–3%异氟烷维持麻醉。定期评估动物的呼吸参数。

3. 手术

  1. 手术部位的消毒与准备
    1. 使用电动剃毛器去除腹部正中切口及经皮穿刺部位覆盖的毛发。
    2. 用聚维酮碘溶液擦洗所有切口部位和经皮穿刺点,并使其自然干燥。
    3. 在手术区域周围铺设无菌巾,以维持无菌手术野并防止污染。使用钉合器将无菌巾固定到位。
    4. 将前肢和后肢的蹄部轻微屈曲并用绳子或胶带固定牵开。
    5. 将心电图粘贴式电极分别置于右前肢、左前肢、右后肢、左后肢以及剑突部位,并正确连接相应的心电图导联线。
  2. 剖腹术
    1. 使用电刀行20 cm长的腹部正中切口。
    2. 使用电刀分离皮下组织和白线,在直视下用剪刀进入腹膜腔。
  3. 脾切除术
    1. 切除脾脏,以防止因失血导致的自体输血反应。
    2. 将脾脏经正中切口拖出,用两把止血钳夹闭脾门血管,在两把止血钳之间切断血管,并用0号丝线结扎断端。
    3. 辨认深部的胃短血管,放置两把止血钳,在两把止血钳之间切断血管,并用0号丝线结扎断端。
    4. 仔细检查已结扎的血管,确认止血完全;如有出血,需进一步结扎处理。
    5. 原位检查脾脏,确保其已完全游离后将其移除。
  4. 膀胱造口术
    1. 经剖腹切口将膀胱牵出至体外。
    2. 用两把DeBakey钳夹住膀胱腹侧壁,用剪刀做1 cm长的切口。
    3. 将吸引导管经切口插入膀胱内,吸尽膀胱中的尿液。
    4. 置入一根14 Fr导尿管至膀胱内,并用10 mL生理盐水充盈导尿管球囊。
    5. 使用3.0尼龙缝线行荷包缝合,将导尿管固定于膀胱内,防止尿液外漏。
    6. 将导尿管连接至尿液收集袋。
    7. 使用3.0尼龙缝线连续缝合关闭剖腹切口。

4. 仪器设备

注意:有关连接 SAAP 电路的关键步骤,请参见表 1

  1. 经皮血管通路
    1. 右侧和左侧颈内静脉插管(图1
      1. 在超声(US)引导下观察颈内静脉;该静脉通常位于颈沟处皮肤下约2-3 cm深度。
      2. 以18 G穿刺针与皮肤呈45°角穿刺皮肤,并在超声实时监视下将其引入静脉腔内,经针管送入0.035” Seldinger导丝。
      3. 撤出穿刺针,注意保持导丝留置于静脉腔内。
      4. 在导丝旁做一5 mm皮肤切口,沿导丝将带扩张器的7 Fr鞘管送入静脉。
      5. 撤出导丝和扩张器,保留鞘管原位。使用1.0丝线将鞘管缝合固定于皮肤上。
      6. 重复上述步骤,对对侧颈内静脉进行插管。
        注:其中一个颈静脉鞘管用于右心房压力监测,另一个可根据研究方案用于药物输注。也可选用颈外静脉进行插管。
    2. 颈动脉插管(图1
      1. 在超声引导下定位位于气管外侧的颈动脉。
      2. 以18 G穿刺针与皮肤呈45°角穿刺皮肤,并在超声实时监视下将其引入动脉腔内,经针管送入0.035” Seldinger导丝。
      3. 撤出穿刺针,注意保持导丝留置于动脉腔内。
      4. 在导丝旁做一5 mm皮肤切口,沿导丝将带扩张器的7 Fr鞘管送入动脉。
      5. 撤出导丝和扩张器,保留鞘管原位。使用1.0丝线将鞘管缝合固定于皮肤上。
    3. 右侧和左侧股动脉插管
      1. 在超声引导下于股管内定位右侧股动脉。
      2. 以18 G穿刺针与皮肤呈45°角穿刺皮肤,并在超声实时监视下将其引入动脉腔内,经针管送入0.035” Seldinger导丝。
      3. 撤出穿刺针,注意保持导丝留置于动脉腔内。
      4. 在导丝旁做一10 mm皮肤切口。
      5. 沿导丝将带扩张器的14 Fr鞘管送入动脉。
      6. 撤出导丝和扩张器,保留鞘管原位。使用1.0丝线将鞘管缝合固定于皮肤上。
      7. 对于左侧股动脉通路,使用超声在股管内定位左侧股动脉。
      8. 以18 G穿刺针与皮肤呈45°角穿刺皮肤,并在超声实时监视下将其引入动脉腔内,经针管送入90 cm长的0.035” Seldinger导丝。
      9. 撤出穿刺针,注意保持导丝留置于动脉腔内。
      10. 在导丝旁做一10 mm皮肤切口。
      11. 沿导丝将一根18 cm长、15 Fr的ECMO导管送入动脉。
      12. 撤出导丝和扩张器,夹闭导管远端以防止反向出血。
    4. 股静脉插管
      1. 在超声引导下于股管内定位股静脉。
      2. 以18 G穿刺针与皮肤呈45°角穿刺皮肤,并在超声实时监视下将其引入静脉腔内,经针管送入0.035” Seldinger导丝。
      3. 撤出穿刺针,注意保持导丝留置于静脉腔内。
      4. 在导丝旁做一5 mm皮肤切口,沿导丝将带导入器的9 Fr中心静脉导管送入静脉。
      5. 撤出导丝和导入器,保留导管原位。使用1.0丝线将导管缝合固定于皮肤上。
  2. 经皮血管监测(图1
    1. 主动脉根部压力
      1. 在透视引导下,将微压导管经右侧颈动脉的7 Fr鞘管插入。
      2. 通过观察数据采集屏幕上显示的主动脉压力波形,确认导管尖端位于主动脉弓内。
    2. 右心房压力
      1. 在透视引导下,将预先校准的微压导管经右侧颈内静脉的7 Fr鞘管插入。
      2. 通过观察数据采集屏幕上显示的压力波形,确认导管尖端位于右心房内。

5. 放血

  1. 准备装置
    1. 通过颈内静脉(IJV)鞘的侧臂注入 15,000 IU 的未分级肝素。
    2. 将放血管路装入用于放血的蠕动泵滚轮中。
    3. 使用标准静脉输液管路将管路的一端连接至体外循环储液器。
    4. 使用直通接头和一段 ¼” 内径、2 英寸长的管路,将放血泵管路的另一端连接至股动脉内 15 Fr ECMO 导管的末端。
    5. 移除 15 Fr 导管上的夹子。
    6. 使用公式5计算对数放血速率时间间隔。间隔长度和放血速率取决于研究方案。
      静态平衡公式,失血量,数学方程,流速计算
    7. 根据实验方案,使用可编程专用泵计算机软件 PUMPTERM 设置所需的泵速。
    8. 使用标准以太网端口将计算机连接至可编程泵。一旦控制泵被编程并显示更新后的初始流速,即可从计算机断开连接。
  2. 泵控放血
    1. 按下泵上的 启动/停止 按钮开始放血。
    2. 按照实验方案继续放血,直至出现无脉电活动(PEA),表现为主动脉压力消失(收缩压 <10 mmHg),主动脉根部压力波形失去搏动性,同时心电图显示窦性心律。
    3. 手动按下泵上的 启动/停止 按钮停止放血。

6. SAAP

  1. SAAP 电路制备
    1. 使用带凸起纹路的Y型和直通接头以及内径为3/8英寸的管路,组装包含再灌注支路、主灌注支路、SAAP灌注支路和外周灌注支路的管路系统(图2)。使用扎带固定连接处。
    2. 将近端管路连接至血液储液器。
    3. 将管路连接至离心泵。
    4. 将管路连接至氧合器。
    5. 使用标准氧气管,将其插入氧合器的氧气灌注端口,以连接氧合器与氧气源。
    6. 将管路主灌注支路装入蠕动泵泵头。
    7. 以6 L/min的流速旋转氧气瓶旋钮供氧。
    8. 向管路储液器中加入15,000 IU的未分馏肝素。
    9. 确认灌注支路的管夹已夹闭,而再灌注支路处于开放状态,以便在放血过程中将流出的血液泵入储血器中。通过按下SAAP回路中的离心泵启动按钮以激活泵 开始/停止 按下按钮并以任意流速设置流速,以使血液循环,防止凝固。
    10. 通过将球囊外部与解剖标志对齐,标记球囊插入长度,目标是使球囊位于胸主动脉近端。
    11. 冲洗SAAP导管,并确认导管接头处已连接三通旋塞阀。
    12. 确认球囊已完全放气,并确认导管在球囊端口处带有双向止流阀。
    13. 用60 mL注射器预先装入含有0.1 mg肾上腺素(1 mL)、10 mL造影剂和49 mL生理盐水的混合溶液。该溶液为用于主动脉瓣(AV)闭合的团注剂,将在SAAP灌注前立即注射,以防止左心室逆向充盈。
    14. 用另一支注射器预先抽取15 mL生理盐水/造影剂溶液(1:1),用于充盈导管球囊。
    15. 将SAAP回路中的蠕动泵设置为以每分钟10 mL/kg动物体重的速率输送灌注液(含氧血液),通过泵旋钮上的“上”和“下”按钮手动编程设定泵速。
  2. SAAP 递送
    1. 将SAAP导管插入股动脉的14 Fr鞘管内至预先确定的长度,将预装有15 mL生理盐水造影剂的注射器连接至球囊端口图2)并注入注射器中的液体以充盈球囊。 
    2. 通过透视检查确认球囊的位置。
    3. 将SAAP灌注支路连接至SAAP导管,外周灌注支路连接至静脉导管(图3).
    4. 通过夹闭SAAP回路的再灌注支来关闭该支路,并通过移除夹子打开灌注支图2).
    5. 将先前预装好AV封闭液团的60 mL注射器连接至SAAP导管动脉管腔三通旋塞的侧端口(图3)并迅速手动注入注射器中的全部液体,随后关闭通向注射器的侧端口。
    6. 立即打开动脉端口三通阀的末端端口。
    7. 通过按下 SAAP 回路中的蠕动泵启动按钮来启动蠕动泵 运行/停止 按钮。
    8. 60秒后,通过按压停止蠕动泵 运行/停止 按钮。
    9. 通过抽吸SAAP球囊端口中的全部液体来使SAAP球囊排气。
    10. 关闭导管动脉腔末端的三通阀,阻断导管内的液体流动。
    11. 评估 SBP 和 ECG 节律。
      注意:若从开始SAAP SBP起2分钟后 < 90 mmHg,可通过SAAP输注最多7次、每次200 mL的肝素化自体回收血或预先购买的枸橼酸抗凝全血,以维持收缩压 >90 mmHg
      1. 若使用储存血液进行SAAP,需同时输注葡萄糖酸钙,以防止枸橼酸盐与心肌中的钙结合。在SAAP灌注前,立即通过连接SAAP导管三通阀侧端口的注射器注射葡萄糖酸钙。每单位浓缩红细胞使用1克葡萄糖酸钙,每单位全血使用3克葡萄糖酸钙。5.
      2. 若动物出现心室颤动或室性心动过速,应尝试除颤:将电极板置于胸骨和心尖处,在确保所有人员已脱离与动物接触后进行电击。
        1. 继续通气,在给予电击前立即断开压力传感器与信号调节单元的连接——在电击完成后立即重新连接。
        2. 使用双相除颤仪,从150 J开始电击,随后评估心律,持续时间最长为1分钟。如果仍存在室性心动过速或心室颤动,则在每次电击后进行1分钟心律评估,再给予最多两次200 J的电击。
          注意:此处使用的除颤算法适用于双相波除颤仪,单相波除颤仪通常需要较低的能量。如果识别出其他心律类型(如心房颤动、无脉电活动等),则不应尝试除颤,而应根据具体的研究方案对动物进行处理。

7. 外周灌注

注意:根据研究方案,在成功进行SAAP复苏后,可继续通过SAAP管路进行外周补液治疗。

  1. 夹闭主灌注支路上的SAAP灌注支路。
  2. 确认SAAP回路的外周灌注支路已连接至股静脉导管的侧臂,且旋塞阀和管路处于开放状态。
  3. 确保SAAP储液器中含有适当种类和体积的复苏液体。
  4. 确保SAAP回路的再循环支路已夹闭。
  5. 根据实验方案需求,设定蠕动泵的适当流速参数以输注液体。

8. 安乐死

  1. 实验结束时,通过向中心静脉注射 >2 mmol/kg 的氯化钾使动物安乐死,并等待 1 分钟以确认心搏停止。

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结果

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基线时主动脉根部血压为83/58 mmHg,在放血过程中逐渐下降至0-10 mmHg。出现无脉电活动(PEA)后,实施SAAP,期间收缩压迅速升高至120 mmHg,并在SAAP持续期间维持该水平(图4)。SAAP停止且主动脉球囊放气后,血压降至约60 mmHg,但在SAAP后期间逐渐恢复至基线水平,期间出现数个代表静脉输液推注的血压尖峰(箭头所示)。

猪心血管系统示意图,显示用于药物输注和压力监测的导管插入位置。
图1:示意图展示猪体内用于数据采集和监测的介入部位。 左侧颈内静脉(IJV)置入7 Fr鞘管,可根据实验方案需求用于给药。右侧颈内静脉置入7 Fr鞘管可用于将压力传感...

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讨论

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充分的灌注液氧合是SAAP12的关键能力。我们使用一种与储液器集成的过滤器,该过滤器通过标准输氧管连接至氧气瓶,以6 L/min的流速将氧气输送至氧合器。回路中集成的离心泵推动血液流经氧合器进行过滤。可通过采集回路灌注支路中的血样进行血气分析,以确认氧合是否充分。在使用该模型进行实验期间采集的血气样本结果显示:pO2 746 mmHg、sO2 100.0%、FO2Hbe 99.2%,证实氧合充足。为实现自主循环恢复(ROSC),必须通过SAAP回路实现充分的灌注。Manning及其同事的研究表明,以每分钟10 mL/kg体重的速率灌注是提高冠状动脉灌注压(CPP)并实现ROSC的最佳流速6。研究还表明,过高的灌注流速可能导致灌注液过多,从而引起心脏超负荷或肺水肿3。回路中的泵必须具备足够的动力,不仅能够推动灌注液流经内径为3/8英寸的管路,还需克服SAAP导管相对较长且管腔较窄的阻力——该导管长度为81 cm,内径为10 Fr。我...

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披露

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JJ Morrison 是 Prytime Medical Inc. 的临床咨询委员会成员。其他所有作者均无任何披露内容。

致谢

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所表达的观点属于作者个人,不代表美国陆军/海军/空军部门、国防部或美国政府的官方政策。

本研究获得了马里兰大学医学院的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3/8” 内径导管Saint-GobainE-3603该导管用于整个管路系统。
1/4" 导管TygonE-36032" 长度的连接段,用于放血导管与ECMO插管之间的连接
两通旋塞阀Harvard Apparatus72-2650标准旋塞阀
三通旋塞阀Harvard Apparatus72-2658标准旋塞阀
带刺接头Harvard Apparatus72-1587Y型连接器
带刺接头Harvard Apparatus72-1575直通连接器
血液储血器LivaNova50715与氧合器配套销售
扎带Commercial ElectricGT-200ST标准扎带
离心泵 BVP-ZISMATECISM 446用于血液再循环的离心泵
可控蠕动分配泵New Era Pump SystemsNE-9000B用于放血的蠕动泵
ECMO插管Medtronic96570-015放血用插管
气体导管AirLife1302标准氧气导管
氧气源AirGasOX USP300带流量计的标准氧气瓶
氧合器LivaNova50715与储血器配套销售
蠕动泵 1 MCPISMATECISM 405SAAP蠕动泵
SAAP导管n/an/a由Manning博士设计的专有导管
静脉导管TeleflexCDC-29903-1A9 法式单腔导管

参考文献

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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