方法文章

高分辨率完整视网膜与玻璃体成像的显微外科解剖与组织透明化技术

DOI：

10.3791/61595

⸱

2021年3月11日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Anatomy, University of Texas Medical Branch, 3Biomedical Engineering and Imaging Sciences Group, University of Texas Medical Branch, 4Department of Ophthalmology, University of Texas Medical Branch

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种完整全 retina 成像的实验方案，通过手术去除眼球外部不透明/含色素的组织层，并应用光学透明化技术使 retina 变得透明，从而可在完整 retina 中利用光片荧光显微镜实现周边 retina 及玻璃体血管系统的可视化观察。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在生理和病理条件下，通过使用完整全视网膜成像技术，相较于传统的视网膜平铺制备和切片方法，能够更清晰地可视化和表征视网膜的神经元和血管结构。然而，完整全视网膜的免疫荧光成像受到眼球不透明外层（即巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮层（RPE））以及视网膜各层光散射特性的阻碍，难以实现全层高分辨率光学成像。已有研究采用化学漂白色素层和组织透明化技术来克服这些障碍；但目前报道的方法尚不适用于在完整全视网膜中对绿色荧光蛋白（GFP）等内源性荧光分子进行成像。其他方法通过手术去除色素层及眼球前段以实现完整眼球成像，从而规避了这一限制，但会破坏周边视网膜和玻璃体结构。本文介绍一种结合巩膜/脉络膜/视网膜色素上皮层（RPE）的手术解剖、改良的组织透明化方法以及光片荧光显微镜（LSFM）的完整全视网膜及玻璃体免疫荧光成像方案。该新方法提供了前所未有的视网膜结构观察视野 视网膜中未受干扰的血管和神经结构，以及在病理状态下玻璃体和玻璃体血管系统。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在健康和疾病状态下，视网膜神经元与血管成分之间的相互作用传统上通过免疫荧光技术对石蜡包埋或冷冻固定的视网膜组织切片，或视网膜铺片进行研究1。然而，组织切片会破坏视网膜神经元和血管的连续性，尽管可通过相邻视网膜切片的三维重建来部分弥补，但该方法仍存在误差和人为假象。视网膜铺片制备也会显著破坏视网膜血管和神经元结构的完整性，以及相邻视网膜区域之间的空间连接关系2。作为替代方法，近年来已引入完整全视网膜成像技术，以在天然解剖位置下可视化视网膜神经元和血管成分的三维投射结构2,3,4,5。

在完整全视网膜成像中，使用光片显微镜捕获完整全视网膜相邻区域（图块）中血管和神经元结构的荧光信号；随后将这些图块“拼接”在一起，以重建整个全视网膜的三维图像2,3,4,5,6。完整全视网膜成像为研究视网膜血管性疾病、变性性疾病和炎症性疾病的发病机制提供了前所未有的观察视角2,3,4,5,6。例如，Prahst 等人通过完整全视网膜的活体成像，在氧诱导视网膜病变（OIR）模型中揭示了病理性血管簇此前未被充分认识的“打结样”形态、异常的细胞运动性以及丝状伪足动态的改变2。类似地，Henning 等人、Singh 等人以及 Chang 等人展示了完整全视网膜中复杂的三维视网膜血管网络3,4,6。Vigouroux 等人采用完整全眼球成像方法，揭示了围产期视网膜结构及其视觉投射的组织特征5。为了实现对视网膜如此卓越的三维可视化，完整全视网膜成像技术已克服了两个主要限制：1）眼球不透明且具色素的包膜（巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮层，RPE）；2）由于视网膜核层和网状层的光散射特性，导致光线难以穿透整个视网膜厚度。Henning 等人和 Vigouroux 等人应用 H2O2 漂白脉络膜/RPE 色素，从而实现对完整视网膜的成像3,5。然而，漂白法不适用于具有内源性荧光蛋白（如绿色荧光蛋白，GFP）的动物品系，或在体内免疫荧光染色后的样本3,5,7。此外，Henning 等人采用的 H2O2 处理方法在水相条件下进行，可能产生微气泡，导致视网膜脱离。而且，H2O2 处理在 55 ˚C 下进行，该条件会进一步降低组织对抗体的结合能力。此外，漂白可能因黑色素氧化而引入强烈的自发荧光8。其他用于眼组织切片的脱色素方案使用高锰酸钾和草酸，虽可去除胚胎组织切片中的 RPE 色素，但该脱色素方法也被证明会降低免疫标记的效率9,10。作为漂白的替代方法，Prahst 等人、Singh 等人和 Chang 等人通过去除巩膜、脉络膜和角膜，使整个视网膜能够被显微镜光线穿透2,4,6。然而，去除角膜、晶状体和周边视网膜可能会扭曲或破坏周边视网膜及玻璃体血管，使得这些方法不适用于对周边视网膜和玻璃体血管系统的研究。

目前所有可用的完整眼球成像方案均包含组织光学透明化步骤，以克服视网膜各层对光的散射特性2,3,4,5。组织光学透明化通过均一化特定组织（此处为视网膜）中所有细胞及细胞间成分的折射率，使视网膜对显微镜光源透明，从而最大限度地减少光的散射和吸收11。由于眼球的色素层（脉络膜和视网膜色素上皮层，RPE）难以被充分透明化，因此在对视网膜进行光学透明化处理前，应先去除或漂白脉络膜和RPE6,12,13,14,15,16,17,18。

在研究早产儿视网膜病变（ROP）、永存胎儿血管（PFV）、Norrie病和Stickler病等病理状态下玻璃体及玻璃体血管系统的参与与作用时，最佳方法是确保视网膜和玻璃体血管在组织制备过程中不被破坏19,20,21,22,23。现有的完整全视网膜成像方法，要么需去除眼球的前段结构，从而不可避免地破坏玻璃体及其血管系统，要么需使用漂白剂，可能导致内源性荧光物质丢失。目前尚缺乏能够对完整、未受干扰的玻璃体及其血管系统进行可视化的已发表方法。本文介绍一种全视网膜与玻璃体成像技术，包括手术剥离眼球表面的色素层和不透明包膜、针对视网膜优化的改良组织透明化处理，以及光片荧光显微镜成像。下文将详细描述样本制备、组织透明化、光片显微镜成像及图像处理的具体步骤。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有实验均经德克萨斯大学医学分部机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。动物的使用与照护均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明。执行本实验所需的所有材料均列于材料表中。操作每一步骤时均需佩戴无粉手套。步骤6和步骤7还需参考显微镜的官方操作手册。

1. 动物准备

  1. 根据适用的机构动物护理和使用委员会批准的方案处死实验小鼠（本实验采用的方法是：使用60 mg/kg氯胺酮和0.5 mg/kg右美托咪定联合麻醉，随后进行颈椎脱位）。立即开始将动物固定在解剖和心脏灌注用平台上。
    注意：实验动物的选择应根据具体研究设计而定。
  2. 解剖腹部和胸腔以暴露心脏。通过将27 G针头插入左心室进行心脏灌注，同时在右心房制造一个小的（约1 mm）切口以允许血液流出24。
    1. 首先灌注30–50 mL冰冻的磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后灌注30–50 mL新配制的4%多聚甲醛（PFA）。
    2. 为确认PFA灌注成功，观察动物全身及尾部是否有明显的肌肉抽搐。随后进入眼球摘除步骤。

2. 眼球摘除与固定

  1. 使用弯头钟表镊轻轻推挤上眼睑或下眼睑，使眼球从眼窝中突出。用另一把钟表镊或类似镊子从侧面刺穿结膜，并从视神经侧夹住眼球。缓慢将眼球从眼窝中提起，直至其与视神经分离。
  2. 用带有剪口尖端的塑料移液管将眼球转移至含有新配制的冰冻4%多聚甲醛（PFA）的离心管中。相应标记离心管。将眼球置于4 °C冰箱中，在4% PFA中固定12小时（过夜）。
    注意：使用剪口尖端的塑料移液管转移眼球。可用第二个移液管尖端扩大剪口处的开口，以避免尖锐边缘损伤样本。

3. 样本解剖（图1 和 图2）

  1. 在体视显微镜下，定位角膜-巩膜交界处（图1A）使用30 G针头的锋利切削端，在角膜-巩膜交界处后方约0.5–1 mm的巩膜上做一个非常表浅的切口（图1B).
  2. 将锐尖解剖剪的一个刀片从刚刚制作的切口处推进，进入巩膜/脉络膜/视网膜色素上皮与视网膜之间的潜在间隙图1C）。推进剪刀并环形剪开，直至巩膜/脉络膜/视网膜色素上皮层可从视网膜外表面剥离（图1D，E).
    注意：执行此步骤时务必缓慢轻柔，以避免刺穿视网膜。最初的几处切口尤为关键，应避免切透视网膜。
  3. 如有需要，可在巩膜/脉络膜/视网膜色素上皮（RPE）上做放射状松弛切口，以利于环形切割以及后续视神经和巩膜/脉络膜/RPE的剥离。去除小片RPE（图1F使用浸有 PBS 的 1 号画笔。
  4. 将完整的眼球转移至含有PBS的离心管中。立即进行下一步操作，或于4 ˚C保存以用于免疫标记。
    注意：如有需要，可在眼球摘除后于眼球上做标记，随后进行解剖以保持眼球的方向定位。本方案可在此暂停，样品可在4 °C冰箱中保存过夜，再进行后续步骤。

4. 血管染色

  1. 将组织浸入含有 0.2% Tween-20 的 PBS 中，室温下处理 20 分钟，以实现组织通透化。
  2. 在摇床上用 PBS 洗涤样本 3 次，每次 10 分钟。
  3. 将样本在含有 0.25% Triton X-100 的 PBS 中，加入 5% 正常山羊血清（NGS），室温孵育 1 小时。
  4. 加入一抗，4 ˚C 过夜孵育。此处使用抗小鼠 Collagen IV 抗体（终浓度用含 0.2% Tween-20 的 PBS 配制）。
  5. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  6. 加入荧光标记的二抗孵育样本。此处使用抗兔 Alexa Fluor 568 抗体，在 4 ˚C 孵育 12 小时（1:200 稀释于含 0.2% Tween-20 的 PBS 中）。
  7. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 1 小时，然后进行组织透明化步骤。

5. 使用 2,2′-硫代二乙醇（TDE）进行光学透明化

  1. 使用TDE储备液与PBS配制工作浓度的TDE溶液，分别配制成体积比（v/v）为10%、20%、30%、40%、50%和60%的溶液。每个眼球样本至少准备2 mL溶液，以确保有足够的过量体积渗透组织。
  2. 将样本置于6孔或12孔板中，依次在浓度递增的TDE溶液中孵育。首先将完整的眼球在10% TDE溶液中于室温下置于摇床上浸没孵育2–4小时。随后，依次将样本转移至更高浓度的TDE溶液中，每种浓度孵育2–4小时（图2C）。
    注意：视网膜在40%–50%浓度时开始透明化，但在60%溶液中孵育后透明化效果最佳。当浓度达到70%及以上时，视网膜透明度反而降低（图2D）。
  3. 如有需要，可在任意连续透明化换液步骤中暂停透明化过程过夜。

6. 使用光片显微镜进行全眼成像

  1. 根据所使用的光片显微镜平台构型，安装完整的眼球样本。按照显微镜和图像采集软件的说明，设置采集参数，包括光片对准以及照明和检测光路的配置。
    注意：本实验中使用的样本是从角膜侧用胶水固定在胰岛素注射器的皮下注射针尖上（图2E）。随后将样本悬挂在显微镜腔室内。
  2. 用60% TDE作为透明化溶液填充显微镜腔室。
  3. 将样本完全浸入光片显微镜腔室中的60% TDE溶液（最终透明化浓度）中。
  4. 使用多种商用或自行搭建的共聚焦显微镜和光片显微镜对透明化后的眼球进行成像。在本方案中，采用双侧照明的光片显微镜。
  5. 使用低分辨率和低倍成像（5x，NA 0.16）来观察细胞形态及细胞过程追踪，尤其是在结合拼图成像时。使用高分辨率和高倍成像（20x，NA 1.0）来观察细胞形态以及较大的亚细胞器，如细胞核和线粒体簇。

7. 采集后图像处理

注意：采集后的处理取决于成像文件的类型以及与之兼容的软件。

  1. 在拼接成像图块之前，应用去模糊或反卷积方法进一步增强原始图像。可使用维纳滤波器对图像进行去模糊处理。或者，可先对图像进行降噪，然后使用理查森-露西反卷积方法及理论或实验测得的点扩散函数（PSF），结合ImageJ PSF生成插件等建模工具进行迭代反卷积25。
  2. 对预处理后的z序列图像进行拼接，并执行仿射与非刚性体体积变换，随后采用多种商业或公共领域软件包（如ImageJ – BigStitcher插件）进行多视角体数据配准与融合26。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

视盘周围血管网络与小胶质细胞的零角度投影如图所示 图3A。此外，CX3CR1中完整全视网膜小胶质细胞的分布-GFP 小鼠被展示于 图3B该方法的一个主要优势在于其能够对内源性荧光物质进行成像。 图3C，D 在采用当前完整眼球成像方法制备的样本中，显示小胶质细胞的代表性Z轴投影（绿色通道）图3C）以及平铺制备（图3D）。在随机选择的感兴趣区域中，对完整全层视网膜和视网膜平铺制备样本中的小胶质细胞进行定量和比较。在小胶质细胞数量方面，视网膜平铺法与完整全层视网膜成像之间未观察到具有统计学意义的差异。图 3E）。所有代表性图像均在 图3 从 CX3CR1 捕获-GF...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

视网膜和玻璃体的发育及其病理变化最适合通过完整眼球视网膜成像技术进行研究，该技术无需将视网膜切割成切片或制备成平铺标本。现有的完整眼球成像方法要么采用色素漂白，这会去除内源性荧光基团，要么需要物理性去除眼球的不透明外层结构（如视网膜色素上皮层、脉络膜和巩膜）以及眼前段组织，这些操作可能干扰周边视网膜和玻璃体结构。Chang 等人和 Prahst 等人去除了眼球的外层结构以及角膜，从而可能破坏玻璃体、玻璃体血管系统及周边视网膜2,4。因此，他们的方法可能不适用于研究涉及玻璃体血管系统的视网膜与玻璃体发育及病理过程中的细胞特征。另一种方法中，Henning 等人和 Vigouroux 等人采用色素漂白技术使脉络膜和视网膜色素上皮层透明化以实现显微成像3,5。然而，色素漂白会消除 GFP 信号，并可能影响其他内源性荧光基团以及用于活体染色的荧光探针的性能7。在本文...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

无相关商业利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作在德克萨斯大学医学部完成。 作者感谢明尼苏达大学的 Harald
Junge 博士、Debora Ferrington 博士以及 Heidi Roehrich 在准备图1和视频2过程中提供的帮助。    LO 获得了美国国家环境卫生科学研究所 T32 培训基金 T32ES007254 的资助。 

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
实验动物
CX3CR1-GFP 小鼠杰克逊实验室5582
麻醉剂
右美托咪定Par Pharmaceutical42023-146-25
氯胺酮Fresenius Kabi
组织采集、固定与样本解剖
心脏灌注泵费希尔科技NC9069235
氰基丙烯酸酯超级胶水amazon.com
精细剪刀—锋利型精细科学工具14160-10
精细镊子精细科学工具11412-11
多聚甲醛（PFA）电子显微镜科学公司15710-S
磷酸盐缓冲液（PBS）吉比科10010049
1号画笔dickblick.com
直型弹簧剪精细科学工具15000-03
注射器，针头尖端，27号 × 1.25"BD
1.5 ml、15 ml、50 ml 离心管赛默飞世尔科技
Tween-20赛默飞世尔85114
免疫荧光染色
抗小鼠胶原蛋白IV抗体Abcamab198081:200 稀释
抗兔 Alexa Fluor 568英潍捷基A-110111:200 稀释
正常山羊血清赛默飞世尔50062Z10% 浓度
组织透明化
2,2′-硫代二乙醇（TDE）Fluka analyticaSTBD7772V
摇床振荡器费希尔科技02-217-765
显微成像
荧光微球TetraSpeckT14792
光片荧光显微镜（LSFM）蔡司Z1
小胶质细胞计数
ImageJ美国国立卫生研究院

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Usui, Y., et al. Neurovascular crosstalk between interneurons and capillaries is required for vision. Journal of Clinical Investigation. 125, 2335-2346 (2015).
  2. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).
  3. Henning, Y., Osadnik, C., Malkemper, E. P. EyeCi: Optical clearing and imaging of immunolabeled mouse eyes using light-sheet fluorescence microscopy. Experimental Eye Research. 180, 137-145 (2019).
  4. Chang, C. C., et al. Selective Plane Illumination Microscopy and Computing Reveal Differential Obliteration of Retinal Vascular Plexuses. bioRxiv. , (2020).
  5. Vigouroux, R. J., César, Q., Chédotal, A., Nguyen-Ba-Charvet, K. T. Revisiting the role of DCC in visual system development with a novel eye clearing method. eLife. 9, 51275(2020).
  6. Singh, J. N., Nowlin, T. M., Seedorf, G. J., Abman, S. H., Shepherd, D. P. Quantifying three-dimensional rodent retina vascular development using optical tissue clearing and light-sheet microscopy. Journal of Biomedical Optics. 22, 076011(2017).
  7. Kim, S. Y., Assawachananont, J. A new method to visualize the intact subretina from retinal pigment epithelium to retinal tissue in whole mount of pigmented mouse eyes. Translational Vision Science and Technology. 5, 1-8 (2016).
  8. Kayatz, P., et al. Oxidation causes melanin fluorescence. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42, 241-246 (2001).
  9. Iwai-Takekoshi, L., et al. Retinal pigment epithelial integrity is compromised in the developing albino mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 524, 3696-3716 (2016).
  10. Alexander, R. A., Cree, I. A., Foss, A. J. The immunoalkaline phosphatase technique in immunohistochemistry: the effect of permanganate-oxalate melanin bleaching upon four final reaction products. British Journal of Biomedical Science. 53, 170-171 (1996).
  11. Ueda, H. R., et al. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  12. Hillman, E. M. C., Voleti, V., Li, W., Yu, H. Light-Sheet Microscopy in Neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 42, 295-313 (2019).
  13. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  14. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  15. Hohberger, B., Baumgart, C., Bergua, A. Optical clearing of the eye using the See Deep Brain technique. Eye. 31, London, England. 1496-1502 (2017).
  16. Kuwajima, T., et al. ClearT: A detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development (Cambridge). 140, 1364-1368 (2013).
  17. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14, 48(2014).
  18. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859-867 (2016).
  19. Hegde, S., Srivastava, O. Different gene knockout/transgenic mouse models manifesting persistent fetal vasculature: Are integrins to blame for this pathological condition. Life Sciences. 171 (15), 30-38 (2016).
  20. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and Management of Retinopathy of Prematurity. New England Journal of Medicine. 367, 2515-2526 (2012).
  21. Pierce, E. A., Foley, E. D., Smith, L. E. H. Regulation of vascular endothelial growth factor by oxygen in a model of retinopathy of prematurity. Archives of Ophthalmology. 114, 1219-1228 (1996).
  22. Ash, J., McLeod, D. S., Lutty, G. A. Transgenic expression of leukemia inhibitory factor (LIF) blocks normal vascular development but not pathological neovascularization in the eye. Molecular Vision. 11, 298-308 (2005).
  23. Reichel, M. B., et al. High frequency of persistent hyperplastic primary vitreous and cataracts in p53-deficient mice. Cell Death and Differentiation. 5, 156-162 (1998).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 3564(2012).
  25. Kirshner, H., Aguet, F., Sage, D., Unser, M. 3-D PSF fitting for fluorescence microscopy: Implementation and localization application. Journal of Microscopy. 249, 13-25 (2013).
  26. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  28. Tian, B., et al. Efficacy of novel highly specific bromodomain-containing protein 4 inhibitors in innate inflammation–driven airway remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60, 68-83 (2019).
  29. Zaman, R. T., et al. Changes in morphology and optical properties of sclera and choroidal layers due to hyperosmotic agent. Journal of Biomedical Optics. 16, 077008(2011).
  30. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  31. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  32. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808(2015).
  33. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PLoS One. 10, 0116280(2015).
  34. Icha, J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. Journal of Visualized Experiments. (110), e53966(2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

GFP
视频即将推出

相关文章