使用最近邻模型对新生小鼠心脏进行克隆分析

摘要

本文介绍了一种利用多色谱系示踪结合最近邻建模方法，在小鼠心脏生长和再生过程中鉴定克隆来源心肌细胞的实验方案。该方法具有客观性，适用于不同的标记条件，并可灵活适配多种图像分析流程。

摘要

通过替换丢失或功能失调的心肌组织，组织再生是治疗心力衰竭的一种有前景的策略。然而，检测真正的心脏再生仍具挑战性，这限制了潜在再生因子的验证。一种检测新生心肌细胞的方法是利用克隆分析进行多色谱系示踪。克隆分析实验的实施可能较为困难，因为标记过于稀疏时，难以灵敏地检测心肌细胞增殖等罕见事件；而标记过于弥散时，则会限制对克隆的分辨能力。本文介绍了一种利用最近邻分布的统计建模方法，对新生小鼠心脏进行克隆分析的实验方案。该方法能够在不同标记条件下实现对心肌细胞克隆的有效分辨，并为定量分析心肌细胞增殖与再生提供了一种可靠的分析手段。该方案可推广至其他组织，广泛用于组织再生的研究。

引言

心力衰竭的组织学特征之一是心肌细胞（CM）的丢失，这种丢失可由损伤、衰老或凋亡引起¹。通过组织再生来补充丢失或功能异常的心肌，是治疗心力衰竭患者的一种潜在治疗策略。在过去的几十年中，发育生物学和再生生物学领域的里程碑式进展揭示了哺乳动物心脏在补充丢失的CM方面具有有限的 能力^2,3,4,5。这些令人振奋的研究表明，有可能利用内在的生长机制实现心脏再生。由于成年哺乳动物心脏中缺乏功能性内在再生反应，因此需要开发增强内源性修复能力的方法，以实现治疗性心脏再生。

先天性心脏再生的机制在不同物种间似乎具有保守性。在受到损伤后，斑马鱼^6,7、蝾螈^8,9、小鼠^4,10、大鼠¹¹和猪^12,13中的已有心肌细胞（CMs）会增殖以产生新的心肌细胞。因此，许多研究团队正致力于鉴定能够促进心肌生成的有丝分裂原。然而，此类研究面临诸多挑战。不仅诱导成年哺乳动物心肌细胞增殖本身已十分困难，而且识别罕见的增殖事件也极具难度^1,14。鉴定罕见的周期性心肌细胞的难度进一步因成年哺乳动物心肌细胞倾向于进行内有丝分裂而加剧。例如，在小鼠心脏受损后，梗死边缘区近25%的心肌细胞重新进入细胞周期，但仅有3.2%的心肌细胞完成分裂⁴。由于大多数进入细胞周期的心肌细胞虽能复制其基因组，却未能完成胞质分裂，因此仅通过检测周期性心肌细胞数量的增加来判断真正的心肌生成具有不确定性。因此，检测心肌细胞对核苷类似物的掺入或检测心肌细胞上增殖标志物的表达，可能无法完全反映心脏再生情况。随着越来越多心脏再生候选因子的发现，亟需建立更精确识别心肌细胞增生的检测方法。

通过谱系示踪进行克隆分析是检测心肌发生的一种有价值的方法，因为它能够直接可视化细胞及其后代。传统的克隆分析方法通常采用报告基因对单个细胞进行稀疏标记。然而，对于心肌细胞（CM）增殖等罕见事件而言，单色谱系示踪稀有细胞的价值可能有限，因为标记到正在增殖的CM的概率较低¹⁵。相比之下，多色谱系示踪可提高克隆分析的灵敏度¹⁶。简而言之，该方法通过随机地为单个细胞遗传标记多种荧光蛋白中的一种，使得增殖的细胞将产生颜色均一的细胞簇，从而可与邻近的其他荧光标记细胞区分开来。此方法已被用于追踪多种器官的生长过程，并且最近已应用于哺乳动物心脏再生的研究^17,18。尽管多色谱系示踪能够在胚胎期和新生期检测到CM的克隆扩增，但在成年小鼠心脏受到损伤后，其内在的再生反应却难以被检测到^17,19。提高多色谱系示踪灵敏度的一种策略是增加标记水平，从而提高观察到罕见事件的概率。然而，更广泛的标记会带来一个问题：无法区分具有相同标记的细胞是来源于共同祖先，还是各自独立地被同一荧光蛋白标记。本文介绍了一种利用最近邻建模方法识别新生小鼠心脏中克隆相关CM的实验方案。该方法无偏倚、可定量，并可在不同标记条件下有效工作。

方案

所有涉及小鼠操作、存活手术以及心脏采集的步骤均须获得当地机构动物使用委员会的批准。

1. 用于心肌细胞克隆分析的小鼠

1. 将 Myh6-MerCreMer 小鼠²⁰ 与 Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw} 小鼠²¹ 杂交，以获得 Myh6-MerCreMer; R26R-Rainbow 双转基因小鼠。
   1. 维持携带 R26R-Rainbow 等位基因的纯合小鼠品系，并将其与携带 Myh6-MerCreMer 等位基因的杂合小鼠进行杂交，使所有实验均在 R26R-Rainbow 等位基因杂合的小鼠中进行。或者，也可使用 R26R-Rainbow 等位基因纯合的小鼠以增加荧光颜色多样性，但这需要具备能够准确区分 EGFP、mCerulean、mOrange 和 mCherry 荧光团的成像系统。
2. 在采集心脏组织的同时进行基因型鉴定。
   注意：Myh6-MerCreMer 小鼠在心肌细胞（CMs）中表达他莫昔芬诱导型 Cre 重组酶，可使用 PCR 引物 CGTACTGACGGTGGGAGAAT（Cre-F）和 GTGGCAGATGGCGCGGCAACA（Cre-R）进行基因型鉴定，扩增出 200 个碱基对（bp）的产物。R26R-Rainbow 小鼠组成型表达 EGFP，但在 Cre 介导的重组后会随机表达 mCerulean、mOrange 或 mCherry。R26R-Rainbow 的基因型鉴定可使用 PCR 引物 CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT（R26-F）、CGAGGCGGATCACAAGCAATA（R26-R）和 TCAATGGGCGGGGGTCGTT（Rainbow-R）。野生型等位基因产生 350 bp 的扩增产物，而 Rainbow 等位基因则产生 250 bp 的扩增产物。

2. 心肌细胞的冷冻损伤与标记

1. 按照先前描述的方法进行冷冻损伤实验，并稍作修改^22,23。将出生一天的小鼠（P1）小心地置于碎冰上，持续3分钟，以诱导心脏停搏。通过夹捏脚趾无反射性回缩来确认麻醉效果充分。
   注意：麻醉时机至关重要。若小鼠冷却时间过长，可能影响存活率。此外，小鼠的年龄也非常关键。其心脏再生能力在出生后的第一周内迅速下降¹⁰。
2. 将麻醉后的小鼠置于冷敷包上，并放置于手术解剖显微镜物镜下。使用6 mm显微剪刀在第4与第5肋之间行胸廓切开术，以暴露心脏前表面。
3. 将预冷于液氮中的冷冻探针置于左心室，持续1-2秒。对于假手术组，仅行胸廓切开术而不实施冷冻损伤。
   注意：冷冻损伤的持续时间决定了损伤程度。过长的冷冻时间将降低存活率。
4. 使用连接在直径0.15 mm针头上的6-0聚丙烯缝合线关闭切口。
5. 迅速复温小鼠，并手动刺激以恢复血流。当小鼠开始自主活动后，将其置于加热垫上。
6. 对恢复后的小鼠腹腔注射20 μg他莫昔芬。如有需要，可同时在缝合线处注射镇痛剂，例如0.25%布比卡因。随后将幼鼠归还母鼠。
   注意：同窝幼鼠应一同复苏并同时归还母鼠。该操作流程有助于提高存活率，并促进母鼠对整窝幼鼠的重新接受。

3. 心脏的收获及组织学分析处理

1. 在损伤后20天（dpi）或出生后第21天（P21）收获心脏，因为此时已可观察到再生反应¹⁰。首先将小鼠置于CO₂吸入式安乐死舱中实施安乐死，然后转移至手术显微镜下。
   注意：安乐死操作应符合机构关于动物使用的指导原则。
2. 确认麻醉充分后，使用手术显微剪进行双侧开胸以暴露心脏。随后依次灌注1 mL 1 M KCl、1 mL 4%多聚甲醛和1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
   注意：充分洗涤有助于减少心室内血凝块，避免成像过程中产生自发荧光。
3. 灌注完成后，取出心脏并置于含有至少1 mL PBS的离心管中。
4. 使用解剖显微镜修剪心脏，以优化包埋效果。在心房下方进行水平切片可为短轴切片提供良好的包埋表面。
   注意：若需长轴切片，可选择横向切割心脏。
5. 将修剪后的心脏置于1 mL 30%（wt/vol）蔗糖溶液中，4 °C孵育12–18 h。取出样本后，使用组织冷冻介质将修剪后的组织包埋成块。
6. 将包埋好的组织在干冰上迅速冷冻，并将组织块储存于−80 ˚C。
7. 使用冷冻切片机将冷冻完整心脏组织块切成10 μm厚的切片，贴附于带电荷的载玻片上，并将载玻片储存于−20 ˚C。连续切片时，按顺序将切片分别贴附于10张载玻片上，待所有10张均贴完第一张切片后，再回到第一张载玻片贴第二张切片。该策略可降低同一张载玻片上多个切片中捕获相同心肌细胞（CMs）的概率。
   注意：应尽量避免光照，以防荧光信号丢失。
8. 成像前将载玻片解冻，并在PBS中复水。加盖#1.5玻璃盖玻片前，加入抗荧光淬灭封片剂。将加盖后的载玻片置于密闭容器中，4 ˚C保存。
   注意：关于冷冻损伤的预期结果，建议读者参考该领域的前期研究工作²³。心脏切片具有较高的自发荧光背景，在加盖玻片前使用淬灭剂（如苏丹黑）有助于降低自发荧光。但需注意避免淬灭目标荧光染料。

4. 成像

注意：以下步骤适用于商用显微镜（参见材料表）的操作，该显微镜配备直立式宽场荧光系统，滤光片组可用于区分 mCerulean、EGFP、mOrange 和 mCherry 荧光蛋白，并配套相应的软件系统（参见材料表）。具体成像系统的不同可能导致额外步骤有所差异。

1. 使用GFP滤光片在5倍放大倍数下对整个切片进行成像，以生成切片图谱。
2. 在切片图谱上选择结构完整且自发荧光较弱的单个区域用于成像。由于切片是以每10张为一组进行连续切片，相邻切片之间至少相距100 μm，从而避免对同一心肌细胞（CMs）重复成像。
3. 使用20倍物镜，结合mCerulean、mOrange、mCherry和EGFP滤光片，对选定的单个区域进行拼接扫描成像。代表性图像见图1。
4. 将图像保存为可提取各单独通道信息的格式。文件命名需谨慎，应能明确标识心脏样本、荧光团类型以及切片在心脏中的位置。后续的计算分析步骤要求采用系统化的命名方式。

5. 分析图像以鉴定标记的心肌细胞

1. 从每组中选择完整无损的成像切片，并随机分发给所有筛查人员。确保每位筛查人员对每张图像都遵循以下步骤。
2. 对于每个通道（mCerulean、mOrange 和 mCherry），在 ImageJ²⁴ 中使用 “颜色平衡” 工具调整图像的亮度和对比度，以帮助用户识别标记的细胞。
   注意：ImageJ 是一款可从 https://imagej.net 免费下载的图像分析工具。本实验方案使用的是版本 2.0.0-rc-69/1.52i。
3. 在 ImageJ 中，从 “分析” 下拉菜单中选择 “设置测量值”。在打开的窗口中，选择 “面积 | 质心 | 边界矩形 | 限制于阈值”。
   注意：有时可使用图像减法模块来增强荧光信号相对于背景自发荧光的对比度。但如果使用减法处理，应在同一数据集的所有图像中系统性地执行。
4. 打开目标图像后，选择 “工具”，然后从 “分析” 下拉菜单中选择 “ROI 管理器”，这将弹出 “ROI 管理器” 窗口。
5. 从 ImageJ 工具栏中选择 “自由手绘选择” 工具，勾勒出目标细胞（图 2A）。勾勒完成后，按下 ‘t’ 键，或点击 “ROI 管理器” 窗口中的 “添加 [t]” 按钮（图 2B）。对单个通道中的所有细胞重复此操作。
   注意：每个通道应单独进行分割和 ROI 标记。
6. 当某一通道的所有细胞均被选中后，将 ROI 保存为 .zip 文件。首先在 “ROI 管理器” 窗口中选择 “取消选择”，确保没有任何单个 ROI 被高亮显示；然后点击 “ROI 管理器” 窗口中的 “更多” 选项卡，并选择 “保存”，此时将打开桌面导航器，可将 ROI 保存为 .zip 文件。
7. 将每个 ROI 的测量结果导出为 .csv 文件。操作时再次通过选择 “取消选择” 确保无任何单个 ROI 被高亮，然后在 “ROI 管理器” 窗口中选择 “测量”，这将打开一个新的 “结果” 窗口，其中包含之前选定的所有测量数据。
8. 在 “结果” 窗口中选择 “文件”，然后从下拉菜单中选择 “另存为”（图 2C），再次打开桌面导航器，以便将文件保存为 .csv 格式。
   注意：在开始下一个通道的分割前，务必先保存当前的 ROI 和测量数据。
9. 命名文件时需谨慎，应采用能够识别心脏样本、通道类型及切片在心脏中位置的格式。例如，“HeartType#_Set#_Section#_Channel”（如 ROI 文件命名为 ‘CI-1_Set4_S3_mOrange.zip’，对应的测量文件命名为 ‘CI-1_Set4_S3_mOrange.csv’）。
   注意：以下代码基于上述命名规则。若使用不同的命名方式，则需相应修改代码。

6. 统计分析

注意：携带相同荧光蛋白的细胞包含克隆来源的细胞（亲缘细胞）和通过随机重组事件表达相同荧光蛋白的非亲缘细胞（非亲缘细胞）的混合物。根据先前的研究数据¹⁷，表达相同荧光蛋白的亲缘细胞在空间上比非亲缘细胞更接近。因此，可通过设定距离阈值来区分亲缘与非亲缘细胞。然而，为了确定该阈值，需要对亲缘细胞和非亲缘细胞的最近邻分布进行解卷积。幸运的是，非亲缘细胞的最近邻分布可通过计算每个细胞到携带不同荧光蛋白的最近细胞的距离值得到估计。本文介绍了通过统计学方法确定定义克隆性的阈值距离，并计算细胞间亲缘关系概率的方法。

1. 使用第5节获得的.csv文件，计算心脏切片中每个细胞的最近邻距离。将这些结果整理为同通道（mCerulean-mCerulean、mOrange-mOrange和mCherry-mCherry）和跨通道（mCerulean-mOrange、mOrange-mCherry和mCherry-mCerulean）距离。将结果分别保存为两个.csv文件：一个用于同通道距离，另一个用于跨通道距离。
   1. 安装 Python²⁵ 需要 numpy 和 pandas 库的代码。
      > pip install numpy; pip install pandas
   2. 使用以下方法计算距离，并导出通道内距离和通道间距离的 .csv 文件 python snippet_6_1.py.
2. 将通道内和通道间的距离读取到 R 中²⁶ 数据框，将心脏标识符转换为分类变量。通过观察最近邻直方图，选择一个经验性阈值。图3A，C) 以尽量减少离群值。应选择一个能够覆盖超过 90% 的跨通道和通道内距离的阈值，同时排除长尾部分，以避免对较大最近邻距离处的噪声过度拟合。本方案采用 400 μm 的阈值（图3）。使用 Rscript snippet_6_2.R 执行此步骤。
   注意：也可以将多个切片建模为独立变量。本方案将模型复杂度限制在心脏层面，以简化建模与参数估计。
3. 获取通道内和通道间距离的自然对数。由于细胞是占据空间的非点状实体，最近邻距离分布的最小值围绕一个非零值分布，且具有不对称的尾部，因为细胞对之间的最大距离可能显著高于中位值图3A，C）。使用对数正态分布对这类分布进行建模（图3B，D）。通过使用 Rscript snippet_6_3.R.
4. 使用以下贝叶斯模型来估计亲缘关系（α）的均值和方差₂σ²₂）和非亲缘个体（α₁，σ²₁）最近邻分布，以及通道内距离源自 kin 分布的概率（π=e^β/(1+e^β)):
   bw.dist_i ~ N(α₁σ²₁l.lim<bw.dist_i<u.lim
   wi.dist_i ~ N(α₁，σ²₁l.lim<wi.dist_i<u.lim)*(1-π) + N(α₂σ²₂l.lim<wi.dist_i<u.lim)*π
   σ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ 均匀分布(2,6)
   α₂ ~ 均匀分布(1,5)
   β ~ Unif(-5,0)
   其中 Unif(a,b) 表示区间 [a,b] 上的均匀分布，N(μ,σ²|l<x<u) 是均值为 μ、方差为 σ 的正态分布² 限定在区间 (l,u) 内，T₁(0,1|x>0）是被限制在正半轴上的标准柯西分布（自由度为1的T分布），bw.dist_i 是 i^th 通道间配对距离的对数值与 wi.dist_i 是 i^th 通道内配对距离的对数值。请注意，通道内距离的对数值呈双组分混合分布，反映了亲缘细胞对与非亲缘细胞对的混合。
   1. 如果可能，为模型提供信息性先验。例如，本方案预期亲缘细胞之间的距离比非亲缘细胞更近，因此将此作为距离分布均值的先验信息。然后，使用 runjags²⁷ 和 coda²⁸ R 包与 JAGS²⁹ 参数估计程序（Rscript snippet_6_4.R).
5. 使用与可用CPU数量相对应的链数来运行JAGS模型。使用 Rscript snippet_6_5.R 执行此步骤，让软件运行直至收敛。
6. 使用指标来检验算法的收敛性，例如有效样本量（可通过 runjags 获得）、Gelman-Rubin 收敛诊断（可通过 runjags 获得）及其自相关性（coda 中提供的 autocorr/autocorr.diag）。通过检查 Q-Q 图来验证所估计模型对最近邻距离的拟合优度，该图绘制了实际值与估计值在分位数水平上对最近邻距离的比较结果。 R脚本片段 snippet_6_6.R (图4C，F）。该脚本要求用户根据命令6的输出结果，编辑 snippet_6_6.R 文件中第25至29行的数值。
   注意：理想情况下，每个参数的有效样本量（SSeff）应超过 10,000³⁰然而，对于某些复杂模型，SSeff 大于 2,500 可能是可接受的。Gelman-Rubin 诊断值在完全收敛时为 1.00，满意收敛时必须小于 1.05。高自相关性表明链内混合缓慢，是收敛速度慢的一个指标。对于良好模型，自相关图应呈现指数衰减趋势。实际与模型拟合的最近邻分布的 Q-Q 图（图4C，F应尽可能贴近对角线。
7. 在验证模型的准确性后，获取细胞对为亲缘关系的概率随其距离变化的函数。为了确定通道内细胞是否可能为亲缘关系的阈值距离，需找出该概率降至0.5以下时对应的距离。此步骤可通过以下方法实现 Rscript snippet_6_7.R
   注意：可根据实验目标选择其他阈值。对于某些应用，阈值可能并不适用，此时可直接使用细胞对为亲缘关系对的概率来加权细胞对。

结果

按照新生小鼠冷冻损伤实验方案操作后，应获得有损伤和无损伤的P21心脏。冷冻损伤心脏具有边界清晰的损伤区域，而假手术心脏表面平滑且均一。在冷冻损伤心脏中，损伤区域应在不同心脏之间保持一致。显微成像后应获得与图1相似的图像。请注意，图像分辨率足以识别单个心肌细胞（CMs），且成像条件允许各荧光染料信号被清晰分辨。此外，请注意损伤并非透壁性，因为较大损伤可能削弱再生反应^23,31。经过图像分割后，获得了每张切片中每种荧光染料对应的心肌细胞坐标数据文件（图2C）。在本研究所展示的分析中，共使用了81张切片（其中46张来自冷冻损伤心脏，35张来自假手术心脏）。每颗心脏的切片数量根据心脏大小在9至17张之间不等，切片间距至少为100 μm，覆盖整个心脏。对文件组织与命名的严谨管理至关重要，再怎么强调也不为过。图像分割提供了计算最近邻距离以及第6步所述建模所需的原始数据。

讨论

多色谱系示踪是一种强大的方法，可用于以单细胞分辨率识别器官生长的模式。然而，多色谱系示踪的一个主要局限在于需要对细胞进行稀疏标记，这可能会降低检测稀有事件的敏感性。对于心肌细胞更新率极低的心脏等器官，这种方法可能导致对生长反应的低估。本文介绍了一种在新生小鼠心脏生长和再生过程中对心肌细胞扩增进行克隆分析的逐步实验方案。尤为重要的是，提供了一种分析框架，通过构建克隆概率的最近邻分布模型来识别克隆。该方法假设增殖细胞彼此之间距离较近，因此可能不适用于存在大量亲缘细胞迁移的系统。

该方法在克隆分析中具有多项优势。与以往的多色谱系示踪研究¹⁷相比，本方案通过成像并分割完整的心脏切片，而非仅分析每张切片中的部分图像，从而扩大了样本量。该分割方法还可确定心肌细胞（CMs）的物理特征，包括细胞大小和形状，为识别增殖性与非增殖性细胞之间的差异特征提供了可能。最后，也是最重要的一点，本分析方法不再假设携带相同荧光蛋白的细胞簇具有克隆相关性，而是提供了一种无偏估计的克隆概率，该估计考虑了细胞标记的密度因素。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#1.5 玻璃盖玻片	FisherScientific	12-544E
6-O 普罗烯	Ethicon	8706H
抗荧光淬灭封片剂	FisherScientific	00-4958-02
CO2 吸入式舱室
冰袋
冷冻模具	VWR	15160-215
冷冻探针	世界精密仪器公司	501313
滤光片组
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw 小鼠
ImageJ 软件			https://imagej.net
KCl 1 M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 冷冻切片机
液氮
显微剪刀，6毫米	世界精密仪器公司	14003
Myh6-CreERT2 小鼠	杰克逊实验室	005657
持针器	World Precision Instruments	14109
4% 多聚甲醛	FisherScientific	AC416785000
磷酸盐缓冲液
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
旋转摇床
体视显微镜
蔗糖 30%（wt/vol）	FisherScientific	BP220
手术解剖剪	世界精密仪器公司	14393
他莫昔芬注射器	VWR	BD328438
他莫昔芬，20 μg	Sigma	T5648
组织冷冻介质	VWR	15148-031
白色磨砂/增强型载玻片	Globe Scientific	1358W
蔡司 Axio Imager M1 正置宽场荧光显微系统
Zen 2.5 Blue 软件