使用激光散斑成像量化脑灌注及磁共振成像量化梗死体积在后循环卒中临床前模型中的应用

摘要

采用犬的大血管闭塞（LVO）卒中模型，开发激光散斑成像技术以实时监测脑灌注。  通过优化弥散加权MRI，使用高b值成像梗死体积，实现表观扩散系数（ADC）和磁共振血管造影（MRA），并与卒中发生时的数字减影血管造影（DSA）结果进行对照。  最后，ADC重建结果与组织学发现相吻合。

摘要

背景： 基底动脉闭塞（BAO）是后循环卒中的一种亚型，其死亡率可高达90%。  目前临床诊断缺血性卒中的标准方法包括计算机断层扫描（CT）、CT血管成像与灌注成像，以及磁共振成像（MRI）。然而，能够准确反映临床疾病特征的大型动物临床前模型，以及用于评估卒中负荷和治疗效果的方法仍十分缺乏。

方法：我们描述了一种后循环大血管闭塞（LVO）卒中的犬类模型，并开发了一种激光散斑成像（LSI）方案，用于实时监测灌注变化。  随后，我们采用高b值弥散加权成像（DWI，b=1800 s/mm²）磁共振成像（MRI）以提高检测敏感性。我们还评估了磁共振血管成像（MRA）评估动脉闭塞的能力，并将其结果与数字减影血管造影（DSA）进行相关性分析。最后，我们通过表观扩散系数（ADC）图谱与组织学结果对照，验证了梗死体积。 

结果：  通过数字减影血管造影（DSA）监测，血栓栓塞的给药成功闭塞了基底动脉（n=7）。   激光散斑成像（LSI）与DSA结果一致，显示卒中发生后脑灌注减少，并在整个实验过程中持续存在，使我们能够实时监测灌注情况。  采用针对犬类优化的b值进行弥散加权成像（DWI），可显示卒中病灶体积，并用于生成表观扩散系数（ADC）图和磁共振血管成像（MRA）图像。实验结束时进行的MRA与闭塞后实施的DSA结果相吻合。最后，MRI上显示的卒中负荷与组织病理学结果一致。

结论：我们的研究利用多模态成像技术，对犬类后循环卒中的血栓栓塞性大血管闭塞模型进行了基于激光散斑成像（LSI）的实时灌注成像，该技术在缺血性卒中的诊断与治疗中具有重要意义。

引言

全球卒中的患病人数接近2570万，其中大多数为缺血性卒中¹。 后循环卒中占所有卒中的20%，其中基底动脉闭塞最为严重，死亡率接近90%^1,2。 1995年，重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）成为首个用于发病3小时内缺血性卒中患者的急性期治疗手段³。近年来，机械取栓已被证实对大血管闭塞（LVO）所致的急性缺血性卒中患者具有显著疗效，此类闭塞包括颈内动脉颅内段、大脑前动脉和大脑中动脉的第一段⁴。 然而，近期的临床试验均未纳入后循环卒中患者，即使采用机械取栓治疗基底动脉闭塞，其预后仍然极差^5,6。  

卒中患者评估技术的进步对预测功能恢复和生存率具有重要影响⁷。既往已有研究描述过椎基底动脉系统卒中的临床前模型^8,9,10，但对卒中负荷和再血管化程度的评估仍不理想。 啮齿类等小型动物具有多种优势，包括易于进行基因操作、动物采购成本低以及日常饲养费用低廉^11,12。然而，小型动物实验有时并不能充分反映大型动物和人类的血管结构、生理状态以及相关的炎症反应⁷。大型动物在模拟人类卒中方面更为接近^2,7,13,14。 此外，可进行系列血液采样，用于血栓性和炎症标志物的血液分析。

本研究中，我们描述了一种通过数字减影血管造影（DSA）从卒中发作初期即验证的犬基底动脉闭塞模型。  我们采用激光散斑灌注成像（LSI）实时监测脑灌注情况。  随后，我们应用一种基于激光散斑灌注成像（LSI）采集数据的新型微血管增强算法 ，并结合高b值磁共振成像（MRI）技术，以优化梗死区域的成像效果¹⁵。这些技术使我们能够监测并量化局部及全脑缺血情况。最后，我们将这些影像学结果与组织病理学进行对照。理解预后并强调在临床前模型中研究后循环卒中的必要性，对于改进治疗策略至关重要。 

方案

所有操作均依照《动物福利法》和美国国家研究委员会（NRC 2011）发布的《实验动物护理与使用指南》进行，并经俄亥俄州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 第一步 动物准备和手术方案 采用先前描述的基底动脉闭塞（BAO）卒中犬模型^9,10。

1. 禁食成年比格犬（8-13 kg，14-21 月龄）过夜，自由饮水。
2. 注射，  麻醉前肌内给予乙酰丙嗪（0.2 mg/kg） 
3. 在头静脉中插入一根 20 号导管。 
4. 通过静脉注射氯胺酮（10 mg/kg）和咪达唑仑（0.025 mg/kg）诱导麻醉。 
5. 麻醉诱导后，对犬进行气管插管，并使用恒定吸入麻醉（2-3% 异氟烷）进行机械通气。 
6. 为激光散斑成像创建一个 1 cm² 的颅骨开窗。 
7. 将 7F 动脉鞘插入右侧股动脉，用于通路建立和血压测量。
8. 将 16 号套管针插入右侧股静脉，用于采血。
9. 制备血栓栓子（血凝块），方法如前所述¹⁶。简言之，在塑料血清采血管中取 5 mL 犬全血，加入 0.5 g 硫酸钡（Ba₂SO₄），边滚动边混合 30 秒。室温下静置混合物 60 分钟，然后经导管给药。
10. 在进入基底动脉中段前，开始记录基线数字减影血管造影（DSA）。在 X 线透视引导下，采用逆行经主动脉路径，将 4F 指引导管经先前置入右侧股动脉的 7F 动脉鞘，通过椎动脉送至基底动脉起始部。注入 2 mL 对比剂与生理盐水混合液，以识别基底动脉。
11. 使用手术刀将血凝块切成小块，包含富含纤维蛋白和富含红细胞的层次¹⁶，装入 3 mL 注射器，经微导管注入基底动脉中段。让血凝块稳定 10 分钟。进行随访血管造影以确认血凝块位置。可通过 DSA 和激光散斑成像（LSI）观察到的脑灌注下降来验证动脉闭塞。

2. 第2步 激光散斑成像 

1. 将激光散斑灌注成像（LSI）相机对准颅窗。按照先前所述方法配置高分辨率激光散斑成像（LSI）相机系统¹⁵。  
2. 在所需时间点进行血管造影时，间歇记录灌注情况。在此犬模型中，使用波长为785 nm、功率为80 mW的激光，在10 cm的工作距离下，以60 Hz的采样率，采集1.5 cm x 1.5 cm视野范围内的数据。
3. 从实时灌注图中选择仅包含较低峰值的时间段（TOI），以排除与呼吸运动相关的伪影。使用PimSoft v1.4软件对10秒采样期内的相对灌注单位进行平均。按照先前所述方法执行激光散斑对比分析（LASCA）¹⁵。  
4. 为优化此犬模型中脑微血管系统的定量分析，以每秒15帧的速度记录图像，并对5 x 5像素区域在5帧范围内进行时空平均的强度和方差计算。强度和方差数据的整体帧率为每秒3帧。为减少犬类呼吸运动引起的灌注读数剧烈突变对均值的影响，选取每个像素灌注值的中位数。将原始数据转换为二进制文件，并处理为有意义的血管成像。采用改进的LASCA算法（rt-LASCA），利用随时间变化的对比度数据方差来确定血管位置，方法如先前所述¹⁵。   

3. 第三步 磁共振成像（MRI）和磁共振血管造影

1. 如需对比，可在手术前一天进行 MRI 检查，随后在确认基底动脉闭塞（BAO）时重复扫描，若需评估治疗效果，则在处死前再次进行 MRI。
2. 将持续麻醉的犬类头先进、仰卧位放置，如前所述 ，置于西门子 Prisma 3 特斯拉磁场强度、60 cm 孔径的 MRI 扫描仪中，配备 32 通道头部线圈作为接收器，并具有增强的并行成像性能，以获取脑部图像¹⁷。
3. 在解剖成像开始前，先进行定位扫描以获取每只犬脑部的引导图像。  用于获取本研究数据的系统集成了成像系统，可在最佳空间和时间分辨率下实现更快的扫描。80 mT/m 的梯度场可生成高质量的 T2 加权图像、弥散加权图像和磁共振血管造影图像。弥散加权成像（DWI）具有足够高的敏感性，能够显示比传统结构 MRI 方法（如 T2 加权图像）更丰富的解剖亚结构。本研究中，MRI 在 BAO 后 4 小时进行。
4. 完成准确定位后，进行 T2 加权梯度回波成像（参数：FOV = 130 mm，矩阵大小 = 320 × 320，像素尺寸 = 0.3 × 0.3 mm，层厚 = 3 mm，TR = 4 s，FA = 180 度，BW = 255 Hz/像素，NEX = 2，TE = 75 ms，分辨率为每毫米 2.4615 像素），随后进行流动衰减反转恢复（FLAIR）成像，以观察脑部解剖结构。
5. 进行磁共振血管造影（MRA）以观察血管解剖结构和血流情况。采用横断面时间飞跃三维（TOF）序列获取覆盖头颈部的脑部 MRA 图像（参数：FOV = 129 × 129 mm，矩阵大小 = 768 × 768，像素尺寸 = 0.3 × 0.3 mm，层厚 = 81.59 mm，TR = 25 ms，FA = 18 度，BW = 185 Hz/像素，NEX = 1，TE = 4.22 ms，分辨率为每毫米 5.91 像素）。采用最大强度投影（MIP）结合三维彩色编码可视化技术，以最大化血管内的信号强度。  对获取的 DICOM 图像进行后处理，以显示血管并确认基底动脉是否闭塞。

4. 第4步 扩散加权成像与每搏输出量计算

1. 进行弥散加权成像序列以检测急性缺血性卒中（参数：FOV = 149 mm × 149 mm，矩阵大小 = 132 × 0 × 0 × 100，像素大小 = 0.30 mm × 0.30 mm，层厚 = 4 mm，TR = 4.6 s，翻转角 = 90 度，带宽 = 255 Hz/像素，信号平均次数 = 1，TE = 86 ms，分辨率为 0.93 像素/mm）。将DICOM图像传输用于后处理。 
2. 由DWI图像生成表观弥散系数图（ADC），并使用OsiriX MD v.5.0软件计算梗死体积。 
3. 逐层勾画双侧大脑半球及梗死区域，并乘以层厚以获得梗死体积。 
4. 将绝对总体积转换为100个单位，以计算每只犬的卒中体积百分比。

5. 第5步 苏木精和伊红染色脑组织学 

1. 在麻醉犬处死时，取出脑组织，用锋利的手术刀切取两片厚4 mm的脑中线切片，其中一片将用于后续的TTC染色。
2. 将4 mm组织切片置于10%福尔马林中固定，时间不少于7天，以确保固定液充分渗透整个切片。
3. 按照我们的方案将固定后的脑组织切片包埋于石蜡中¹⁷. 
4. 修整并调平每个石蜡包埋块（可同时储存和处理多个包埋块）。 
5. 将每个石蜡包埋块切片至4μm，并将切下的组织置于2" × 3" 英寸载玻片
6. 将每张切片在 Hematoxylin 560 中处理 8 分钟，用 1% 酸性乙醇分化，每次 1 秒，重复三次，每次分化后用自来水冲洗。 
7. 用1%的氨水将每张载玻片染蓝1秒，然后用自来水冲洗2秒。
8. 在70%乙醇中脱水，每次1秒，重复十二次，伊红复染1分钟。
9. 用95%乙醇处理1秒，重复十二次，随后用100%乙醇脱水。 
10. 用二甲苯透明并应用2" x 3" 用封片剂将盖玻片封固，避免产生气泡。

6. 第6步 2% 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物脑染色

1. 将之前在H&E切片旁获取的另一段4 mm脑组织切片放入预先配制的溶液中，该溶液含有100 mL pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中2%的2,3,5-三苯基-2H-四氮唑氯化物（TTC），并在37 °C避光条件下预热。
2. 于37 °C避光孵育至少20分钟，每隔5分钟轻轻翻转脑切片一次。 
3. 当切片两面均变为樱桃红色时，移除TTC溶液，并替换为pH 7.4 PBS中的4%多聚甲醛溶液，以在过夜期间优化染色对比度。 
4. 当脑组织中白色与红色染色区域之间的对比度达到最佳（1–3天）时，将切片置于透明塑料片之间，吸去多余液体，并进行高分辨率扫描。
5. 参照先前所述方法¹⁷，勾画缺血区域及整个脑切片轮廓，计算每张切片的梗死面积百分比。 

结果

激光散斑血流灌注记录与成像： 在动物被运送至 MRI 检查前以及最终处死时，持续进行血流灌注记录（图 1A）。数据显示，在基底动脉闭塞前（pre-BAO）时间点，脑部灌注下降约 15%，降至 83 ± 10%。这一轻微下降可能源于远端椎动脉内微导管的插入。注射自体血栓栓子后，BAO 后的灌注量平均下降至 33 ± 2.6%，较基线水平下降约 67%（图 1B）。血管造影观察显示，基底动脉在 BAO 前血流通畅（图 2A），而在注入自体血栓后完全闭塞（图 2B）。与血管造影结果一致，通过颅窗进行的激光散斑灌注成像（LSI）显示，闭塞前灌注无受限（图 2C），而闭塞后灌注明显受限（图 2D）。随后验证了 BAO 模型中栓塞的有效性。为此，采用实时激光散斑...

讨论

后循环卒中最常见的病因包括栓塞、大动脉粥样硬化和小动脉病变⁵。基底动脉闭塞（BAO）是后循环卒中的一种亚型，具有较高的致残率和死亡率¹³。在此背景下，本研究采用了一种犬急性后循环卒中模型，并建立了一种激光散斑灌注成像（LSI）方案，用于实时监测闭塞区域的血流灌注情况。通过一个小型颅窗进行激光散斑灌注成像，可实时获取特定感兴趣区域的灌注信息。卒中发生后，灌注水平下降，并持续至实验结束。  该颅窗可提供溶栓药物或取栓装置治疗后灌注变化的实时信息。  在通过颅窗完成LSI成像后，进一步利用rt-LASCA算法对灌注数据进行处理，以可视化卒中受累区域的血管解剖结构¹⁵。  本研究中，激光散斑灌注成像所记录的后循环闭塞结果与术中血管造影结果相一致。尽管该颅窗制作耗时不足5分钟，可根据研究需求进行调整，但其实际尺寸仅略大于成像视野。因此，扩大颅窗只会增加周围组织损伤和出血风险，而无法通过设备扩展成像范围。尽管如此，该方法可用于评估溶栓剂、预防性药物或任何可能改变脑血流的药物，且...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% 氯化三苯基四氮唑（TTC，溶于PBS，pH 7.4）	Sigma Aldrich	T8877
EDTA K3 真空采血管	Becton Dickinson	BD455036
伊红	Surgipath	3801602
10% 中性缓冲福尔马林	Richard-Allan Scientific	5701
苏木精 560	Surgipath	3801570
HUG-U-VAC 定位系统	DRE 兽医	1320
LabChart 软件	ADInstruments 公司
激光散斑成像相机	Perimed 公司，瑞典耶尔费拉	PeriCam PSI HR 系统
锂肝素真空采血管，4.5%	Becton Dickinson	BD 368056
Matlab	The MathWorks, Inc.，美国马萨诸塞州纳蒂克
OsiriX MD v.5.0 软件	Pixmeo Inc，日内瓦
PBS 中的 4% 多聚甲醛	Alfa Aesar	AAJ61899AP
PimSoft v1.4 软件	Perimed 公司	随LSI设备提供的软件
Prisma Fit 3 特斯拉（3T）磁共振成像仪	西门子诊断
注射用肝素钠（用于涂覆血气针筒）	NovaPlus	402525D